转基因小鼠的鉴定

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1、转基因小鼠的鉴定SANY GROUP system office room【SANYUA16H-转基因小鼠的鉴定一、剪鼠尾1. 剪鼠尾的时间 当新生的小鼠年龄达到两到三周（耳朵已经长开）时剪鼠尾较好 此时鼠尾剪起来比较容易且小鼠的生命力比较强。2. 分辨小鼠的年龄a当小鼠整个身体较红且腹部无奶时，此小鼠当天出生或前一晚出生；b 当小鼠腹部有奶（腹部有一小团白色物质），此小鼠出生 23 天；c当小鼠背部长出皮毛时，此小鼠出生34天；d当小鼠毛长全，但眼未开时，此小鼠出生10天左右；e当小鼠眼刚开，耳未开时，此小鼠出生12天左右；f当小鼠耳刚开时，此小鼠出生14天左右。3. 剪鼠尾后对小鼠的标记

2、：打耳孔法二、从鼠尾中提取 DNA采用鼠尾基因组DNA提取试剂盒（康为世纪：cw2094）提取DNA，操作如下：1. 剪取小鼠长度为0.4-0.6cm的尾巴，放入灭菌后的离心管中，加入180吐BufferGTT。震荡混匀。2. 加入20吐proteinase K,涡旋震荡，彻底混匀。3. 置于56C。水浴，直到组织溶液完全清澈，一般需消化6-8h，赋予过程中涡旋震荡,使样品均匀分离。注意：1）如果赋予和涡旋震荡后仍然有胶状物质，必要时过夜消化再加入20卩1proteinase K 消化，不会影响后续操作。2）如需去除RNA,可在上述步骤完成后，加入4卩1浓度为lOOmg/pl的RNase A

3、溶液，震荡混匀，室温放置 5-10min。4.14000rpm离心lmin,以消除未消化的类似于鼠毛等组织，将上清转移到一个新的 灭过菌的离心管中。5. 加入200pl Buffer GL,涡旋震荡，充分混匀，加入200pl无水乙醇，涡旋振荡，充 分混匀，短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。注意：1）加入Buffer GL和无水乙醇后要立即涡旋震荡混匀。2）如果多个样品一起操作，Buffer GL和无水乙醇可以等比例混匀后一起加入样 品。3）加入Buffer GL和无水乙醇后可能会产生白色沉淀，不会影响后续操作。6. 将步骤5中所得到的溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱中，若以此不能加完溶 液

4、，可分多次转入。10000rpm离心1min,倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放 回收集管中。7. 向吸附柱中加入500卩l Buffer GW1 （使用前检查是否已加无水乙醇），10000 rpm离 心1min,倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。8. 向吸附柱中加入500卩l Buffer GW2 （使用前检查是否已加无水乙醇），10000 rpm离 心1min,倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。如需进一步提高 DNA纯度，可重复步骤8。9. 12000rpm离心2min,倒掉收集管中的废液，将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾 注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的乙醇去

5、除，乙醇的残留会影响后续的酶促 反应（酶切，PCR等）。10. 将吸附柱置于一个新的灭过菌的离心管中，向吸附柱的中间部位悬空加入 50-200yl Buffer GE或灭菌水，室温放置2-5min, lOOOOrpm离心lmin,收集DNA溶 液，-20C。保存DNA注意：1）如果下游实验对PH值或EDTA敏感，可以用灭菌水洗脱，洗脱液的PH值对 洗脱效率有很大影响，若用水作洗脱液应保证其PH值在7.0-8.5直接，PH值低于 7.0时洗脱效率不高。2）离心前室温孵育5min可增加产量。3）用另外的50-200yL Buffer GE或灭菌水再次洗脱可以增加产量。4）如果需要提高DNA的终浓度

6、，可以将步骤10所得的DNA洗脱液重新加至吸 附膜上，重复步骤10；若洗脱体积小于200卩L,可以增加DNA的终浓度，但可能 会减少总产量。三、PCRPCR程序设定：1= 94.0C for 5:002 = 94.0C for 1:003= 59.0C for 0:504= 72.0C for 1:005= Goto 2 2times6= 94C for0:507= 58C for 0:508 二 72C for 1:009 二 Goto 6 2times10= 94.0C for 0:5011 二 56.0C。for 0:5012= 72.0C for 1:0013= Goto10 32ti

7、mes14= 72.0C for 10:0015= 4.0C for 5:0016 = END目前实验室的双转基因小鼠AD体系采用：PCR反应的体系（12pl）：APPPrimer APP-1 1.3 plPrimer APP-2 1.3pl ddH2O2plmix（CW0682） 6plDNA1plPCR反应的体系（12pl）：PS1Primer PS1-11.3plPrimer PS1-21.3pl内参-11pl内参-21plmix（CW0682） 6plDNA1pl先在1.5ml的EP管中加入总的体系再平均分装入各个PCR管中（一般多加两小管的量），将移液器调到总量的1/3到1/2体积在

8、EP管中缓慢抽吸若干次（尽量避免产生气泡）以便Taq酶混合均匀，最后再在各PCR管中依次加入DNA样品。引物处理方法：引物在安基生物有限公司合成后，EP管上会有标记，一般为xnmol,使用前先用12000rpm离心lmin,加入10x pl ddH2O,涡旋振动混匀，微型离心 机离心，即可得到100pM的母液，取10pl的母液，用ddH2O稀释10倍，即加入 90pl，混匀后即可得到10pM的引物工作液。四、电泳1配胶：鉴定用的胶板有大、中、小 3种，分别用的梳子为 50、25、11齿。分别用的0.5*TBE的量为90ml、45ml、25ml。用1.5%的琼脂糖凝胶。2 . 点样:12pl的DNA, Marker加5pl。点样时注意逐个点样，不要点错，最 好把中间的那个孔留着点Marker，这样可避免点样的出错。Marker的选择依基因 片段大小而定。3. 跑电泳：打开电源，150v电压，30min左右即可。4照胶：看是否有目的条带，即可判断对应小鼠是阳性、阴性或是杂合子。5.保存。