干细胞和干细胞治疗.ppt.ppt

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1、1 干 细 胞 和 细 胞 治 疗 stem cell and cell therapy 2 + 未 分 化 细 胞+ 自 我 更 新 (self-renew)+ 无 限 增 殖 体 外 长 期 培 养+ 多 向 分 化 潜 能 (multipotential) 3 4 胚胎干细胞 embryonic stem cells 胚 胎 干 细 胞 主 要 是 指 来 自 囊 胚 内 细 胞 团 的 细 胞 ， 有自 我 更 新 和 多 向 分 化 潜 能 ， 可 以 分 化 为 内 、 中 、 外 三个 胚 层 的 各 类 细 胞 。 成体干细胞 adult stem cells 成 体 干 细

2、胞 是 处 于 干 细 胞 状 态 的 成 体 细 胞 ， 包 括 成年 和 未 成 年 动 物 组 织 中 的 各 种 干 细 胞 ， 因 此 又 称 为 组织 干 细 胞 。 如 神 经 干 细 胞 、 造 血 干 细 胞 、 骨 髓 间 质干 细 胞 、 上 皮 干 细 胞 、 肝 干 细 胞 、 胰 腺 干 细 胞 等 。 5 胚 胎 干 细 胞embryonic stem cells（ES细胞） 6 7 8 将 囊 胚 内 细 胞 团 的 细 胞 通 过 体 外 培 养 产 生 未 分化 的 细 胞 克 隆 ， 建 立 胚 胎 干 细 胞 系+ 1 9 8 1 年 Evans 和 M

3、artin 首 次 成 功 分 离 和 建 立 小 鼠胚 胎 干 细 胞 系+ 1 9 9 8 年 Thomson 等 首 次 成 功 分 离 和 建 立 人 胚 胎 干细 胞 系 胚 胎 干 细 胞 可 在 体 外诱 导 分 化 形 成 各 种 成 体 细 胞 9 + 外 源 诱 导 因 子 诱 导 ES细 胞 分 化 诱 导 因 子 ： 维 甲 酸 (RA)、 骨 形 成 蛋 白 BMPs)、 成 纤 维 细 胞生 长 因 子 (FGFs)等+ 转 基 因 诱 导 ES细 胞 分 化 用 转 基 因 技 术 使 某 种 促 分 化 基 因 在 ES细 胞 中 表 达 、 调 节 其分 化+

4、 与 其 他 细 胞 共 培 养 诱 导 ES细 胞 分 化 创 造 细 胞 分 化 的 微 环 境 10 11 成 体 干 细 胞adult stem cells又称组织干细胞tissue stem cells 12 + 成 体 干 细 胞 又 称 组 织 干 细 胞 ， 传 统 的 观 念 认 为 它们 是 存 在 于 成 体 组 织 的 未 分 化 细 胞 ， 现 在 认 为 也包 括 未 成 年 动 物 的 组 织 干 细 胞 ， 它 们 具 有 不 断 增殖 和 自 我 更 新 能 力 、 又 具 有 多 向 分 化 潜 能 。 如 造 血 干 细 胞 、 骨 髓 间 质 干 细 胞

5、 、 神 经 干 细 胞 、脂 肪 干 细 胞 、 上 皮 干 细 胞 、 胰 腺 干 细 胞 、 肝 干 细胞 等 13 + 自 然 条 件 下 成 体 干 细 胞 倾 向 于 分 化 成 所 在组 织 的 细 胞 ， 参 与 组 织 更 新 和 损 伤 修 复 ；+ 外 界 条 件 诱 导 下 成 体 干 细 胞 可 横 向 分 化 成其 他 组 织 的 细 胞 ， 参 与 这 些 组 织 的 损 伤 修复 。 14 15 16 + 细 胞 治 疗 + 组 织 工 程 + 药 物 筛 选 + 发 育 研 究 + 基 因 功 能 研 究 17 细 胞 治 疗 是 指 将 正 常 或 遗 传

6、改 造 过 的 人 体 细 胞 直 接 移 植或 输 入 患 者 体 内 ， 以 达 到 替 代 受 损 细 胞 、 治 疗 疾 病 的 目 的。 利 用 干 细 胞 及 其 分 化 细 胞 进 行 细 胞 治 疗 是 干 细 胞 临 床 应用 的 重 要 研 究 方 向 。 胚 胎 干 细 胞 和 成 体 干 细 胞 都 能 用 于 细 胞 治 疗 ， 但 目 前 只有 少 数 成 体 干 细 胞 在 细 胞 治 疗 上 己 开 始 取 得 临 床 疗 效 ， 大多 数 的 干 细 胞 治 疗 还 在 实 验 阶 段 。 18 如 白 血 病 的 细 胞 治 疗 造 血 干 细 胞 移 植

7、： 自 体 移 植 （ 脐 带 血 造 血 干 细 胞 ） 无 排 斥 反 应 同 系 移 植 （ 同 卵 孪 生 之 间 骨 髓 造 血 干 细 胞 ） 一 般 无 排 斥 反 应 同 种 移 植 （ 人 与 人 之 间 骨 髓 造 血 干 细 胞 ） 有 排 斥 反 应 （ 供 、 受 者 组 织 相 容 性 抗 原 不 同 ） 需 组 织 配 型 、 选 择 供 者 （ 骨 髓 库 ） ； 抑 制 受 者 的 免 疫 应 答 、 诱 导 免 疫 耐 受 。 19 如 帕 金 森 氏 病 细 胞 治 疗+ 胚 胎 干 细 胞 细 胞 移 植+ 神 经 干 细 胞 细 胞 移 植 1 、 干

8、 细 胞 直 接 移 植 2 、 诱 导 分 化 成 相 应 神 经 细 胞 （ 多 巴 胺 能 神 经 元 ） 后 进 行 细胞 移 植 20 如 心 肌 梗 塞 的 细 胞 治 疗 胚 胎 干 细 胞 诱 导 分 化 成 心 肌 细 胞 细 胞 移 植 成 体 干 细 胞 （ 骨 髓 基 质 干 细 胞 、 脂 肪 干 细 胞 、 心 肌 干 细 胞 等 ） 诱 导 分 化 成 心 肌 细 胞 细 胞 移 植 21 异 体 移 植 的 免 疫 排 斥 反 应 解 决 途 径 ： 自 身 体 细 胞 核 移 植 （ 治 疗 性 克 隆 ） 干 细 胞 基 因 改 造 采 用 自 身 干 细

9、胞成 瘤 性 的 危 险 胚 胎 干 细 胞 植 入 动 物 体 内 会 形 成 畸 胎 瘤 ， 如 何 防 止 干 细 胞 移 植 后 可 能因 分 化 不 彻 底 形 成 肿 瘤 ， 是 必 须 解 决 的 问 题 。 解 决 途 径 ： 完 善 定 向 诱 导 分 化 方 法 改 进 筛 选 纯 化 技 术 22 + 23 胰 腺 干 细 胞 的 细 胞 分 化与I 型 糖 尿 病 的 干 细 胞 治 疗 24 + 外 源 胰 岛 素 治 疗+ 胰 腺 或 胰 岛 移 植+ 干 细 胞 治 疗 ： 胚 胎 干 细 胞 诱 导 分 化 成 细 胞 细 胞 移 植 基 因 导 入 使 其 表

10、 达 胰 岛 素 细 胞 移 植胰 腺 干 细 胞 诱 导 分 化 成 细 胞 细 胞 移 植 25 26 + 人 胎 胰 腺 nestin阳 性 细 胞 的 分 离 、 体 外 培 养 和生 物 学 特 性 检 测 （ 目 的 是 确 认 NIPs是 胰 腺 干 细胞 ） ；+ 体 外 诱 导 分 化 NIPs形 成 能 产 生 胰 岛 素 的 细 胞；+ 类 胰 岛 细 胞 团 (ICCs)异 种 体 内 移 植 糖 尿 病 的干 细 胞 治 疗 实 验 研 究 。 27 +人胎胰腺 nestin阳性细胞( NIPs )的分离、体外培养和生物学特性检测 28 nestin 阳 性 细 胞

11、位 于 胰 腺 小 导 管 壁 及 其 相 连 的 原 始 细 胞 团 在 EHAA 培 养 液 中 的胎 胰 导 管 和 细 胞 团 培 养 48小 时 后 细 胞 贴 壁并 开 始 铺 开 CK19 insulin nestin 呈 CK19 阳 性 的 胰 腺上 皮 细 胞 （ 细 胞 较 大 ) 呈 胰 岛 素 阳 性 的 细 胞 （ 细 胞 较 小 ） nestin阳 性 细 胞 (NIPs) （ 梭 形 ） 31 DMEM/F1 2 培 养 液 中 加生 长 因 子 bFGF促 进 梭 形细 胞 (NIPs)体 外 扩 增 。亚 克 隆 纯 化 、 传 代 培 养图 为 由 单 个

12、 梭 形 细 胞 (NIPs)的 扫 描 电 镜 照 片梭 形 细 胞 (NIPs)可 在 体 外长 期 传 代 培 养 nestin semi quantitative RT-PCR筛 选 培 养 的 梭 形细 胞 (NIPs)集 落 免 疫 组 化 显 示 筛 选 培 养的 细 胞 均 呈 nestin阳 性反 应 半 定 量 RT-PCR显 示 筛 选培 养 的 细 胞 表 达 nestin和ABCG2 nestin NIPs达 到 80% 铺 满 时可 自 发 形 成 小 的 ICCs NIPs能 自 发 形 成 类 胰 岛 细 胞 团 (ICCs).NIPs 在 DMEM 培 养 液

13、 (含 11.1mM 葡 萄 糖 、 10%FBS 和 20ng/ml bFGF) 中 培 养 免 疫 组 化 显 示 这 种 ICCs主 要 由 nestin 阳 性 细 胞组 成 RT-PCR 显 示 这 种 ICCs 高 水 平 表 达 ABCG2 和 nestin RT-PCR analysis 培 养 2周 后 形 成 的 ICCs大 而 致 密 glucagon NIPs 具 有 多 向 分 化 潜 能 培 养 液 中 撤 去 bFGF使 NIPs分 化 RT-PCR analysis免 疫 组 化 显 示 此 时ICCs表 达 glucagon RT-PCR显 示 此 时 ICC

14、s有 多 种 谱 系 基 因 的 表 达 ，具 有 向 胰 腺 多 种 类 型 细胞 分 化 的 能 力 35 + ABCG2 是 ABC 运 输 蛋 白 （ ATP binding cassette transporter） 家 族 成 员 ， 其 功 能 是 将 细 胞 内 的 促 分 化 因 子泵 出 细 胞 以 维 持 干 细 胞 的 未 分 化 状 态 ， 现 在 认 为 它 是 干 细胞 状 态 决 定 因 子 。 已 有 报 道 ES细 胞 、 造 血 干 细 胞 、 骨 髓 间质 干 细 胞 、 神 经 干 细 胞 、 肌 干 细 胞 等 均 表 达 ABCG2。 36 +体外

15、诱导分化 NIPs形成产生胰岛素的 细胞； 培 养 10天 后 形 成 很 多大 而 致 密 的 ICCs insulin RT-PCR analysis免 疫 组 化 显 示 ICCs 中 有胰 岛 素 阳 性 的 细 胞 此 时 ICCs 表 达 细 胞 的 标 志 ， 但 仍少 量 表 达 NIPs和 其他 细 胞 的 标 志 38+ 细 胞 诱 导 分 化 后 的 ICCs (ICC3) 细 胞 内 胰 岛 素 含 量 明 显 高 于 多向 分 化 的 ICCs(ICC2)， 但 仍 低 于 胎 胰 胰 岛 (islet) 的 胰 岛 素 含 量 insulin secretion i

16、n response to glucose T: tolbutamideC: carbacholG: GLP-1 insulin secretion in response to secretagogues在 不 同 浓 度 葡 萄 糖 刺 激 下ICCs中 细 胞 胰 岛 素 分 泌 量与 萄 葡 糖 浓 度 呈 正 相 关 各 种 分 泌 刺 激 因 子 刺 激 ICCs释放 胰 岛 素 。 T-甲 苯 磺 丁 脲 C-碳 酰 胆 碱 G-胰 高 血 糖 素 样 肽 40 +这一实验结果表明：NIPs 具有多向分化潜能，在一定条件下能定向分化为功能性 细 胞 . 41 +类胰岛细胞团 (I

17、CCs)异种体内移植 糖尿病的干细胞治疗实验研究。 （ 将 定 向 诱 导 人 NIPs 形 成 含 细 胞 的 ICCs 移 植 到 严 重 联 合 免 疫 缺 失 小 鼠 体 内 ） 42 NOD-Scid小 鼠 腹 腔 内 注 射streptozotocin 肾 膜 下 移 植 含类 细 胞 的 ICCs高 血 糖 注 射 STZ前 注 射 STZ后 移 植 ICCS后 30 20 10 血 糖 水 平(mmol/l) 注 射 后 3天 小 鼠 出 现稳 定 的 高 血 糖 症 移 植 4天 后 小 鼠血 糖 明 显 下 降 insulin 左 肾 移 植 部 位 移 植 后 40天 ，

18、 移 植 部 位 血 管 增 生 免 疫 组 化 显 示 移 植 部 位 的 胰 岛素 阳 性 细 胞 移 植 ICCs后 血 糖 明 显 下 降 (P0.05) STZ 处 理 3天 后 所 有 NOD-Scid 小 鼠 出 现 高 血 糖 ， 移 植 4天 后 小 鼠血 糖 水 平 下 降 至 接 近 正 常 并 保 持 稳 定 至 40天 ， 未 移 植 的 小 鼠 保持 高 血 糖 。 移 植 40天 后 ， 移 植 物 在 移 植 部 位 发 生 异 常 增 殖 并 侵 入 肾 实 质 ， 形 成 导管 、 细 胞 团 、 血 管 等 结 构 。 肾膜下区域 侵入肾实质区域 * *

19、renal tubule 可 见 导 管 和 细 胞 团 肾 小 管 附 近 可 见 导 管 和 血 管 47 +这一实验结果表明： 移植的 ICCs可在糖尿病小鼠体内特殊环境下进一步分化生成更多类细胞，合成和分泌适量胰岛素，能显著降低血糖水平。但在正常小鼠中能多向分化、异常增殖。 48 1 , 糖尿病小鼠体内微环境对ICCs的定向诱导分化作用，可能使糖尿病的干细胞治疗成为可能。 在体内诱导较体外彻底， 细胞比例高于体外，能显著降低糖尿病小鼠血糖水平，说明糖尿病小鼠体内特殊环境有利于ICCs向细胞分化。 （1）糖尿病小鼠的血清可作为胰腺干细胞体外培养的诱导因子，其中高浓度葡萄糖和胰高血糖素样肽

20、1 (GLP-1 )起主要作用。 （2）移植部位血管增生，为生长和分化提供营养並有利于胰岛素及时进入血液循环。 49 2 , 干细胞治疗的安全性问题不容忽视。 （1）干细胞诱导分化的不彻底性有待解决。ICCs在正常小鼠体内的异常增殖，反映ICCs中存在较多未分化细胞，如何控制诱导分化的方向和纯度並有效抑制可能的恶性增殖是目前干细胞治疗研究碰到的棘手问题。 （2）干细胞移植会不会致癌仍是有待解决的问题。肿瘤干细胞 (cancer stem cell) 理论认为干细胞与癌细胞在增殖调节机制方面有着相同的信号途径和调控因子，癌症可能起源于异常活化的干细胞。ABCG2是一种干细胞标志分子，同时又是多种

21、癌细胞的抗药基因，可能是联系干细胞和癌细胞的分子基础之一。 50 3 , 胰腺干细胞治疗的免疫排斥问题没有完全解决。 （1）异体移植的免疫排斥 （2）自身免疫反应 I 型糖尿病是一种自身免疫性疾病，自身细胞被自己的 T 细胞误认为 异已细胞而遭受免疫攻击。因此即使自身的干细胞移植，可以避免异体免疫排斥，可能仍会遭遇自身免疫反应。 51 从 人 胎 胰 分 离 的 nestin 阳 性 细 胞 表 达 ABCG2， 具 有 干 细 胞 特 性 ， 在 体 外 能 诱 导 分 化 成 有 功 能的 细 胞 ， 移 植 至 糖 尿 病 小 鼠 体 内 可 产 生 胰 岛 素、 降 低 血 糖 水 平 。 胰 腺 干 细 胞 有 着 用 作 细 胞 治 疗的 前 景 ， 但 不 少 问 题 （ 安 全 性 问 题 、 免 疫 排 斥 问题 等 ） 有 待 进 一 步 研 究 ， 到 临 床 应 用 还 有 一 段 路要 走 。 52 53 谢 谢 ！