罗氏公司TUNEL细胞凋亡检测程序

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1、罗氏公司 TUNEL 细胞凋亡检测程序罗氏公司 TUNEL 细胞凋亡检测程序（ In situ cell death detection kit-POD 法）一、原理：TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling ）细胞凋亡检测试剂盒是用来检测组 织细胞在凋亡早期过程中细胞核DNA的断裂情况。其原理是荧光素（fluorescein）标 记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT Enzyme）的作用下，可以连接到凋亡细 胞中断裂DNA的3-OH末端，并与连接辣根过氧化酶（HRP，horse-radish peroxidase） 的荧光素抗体特异性结合，

2、后者又与HRP底物二氨基联苯胺（DAB） 反应产生很強的颜 色反应（呈深棕色），特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在光学显微镜下即可观 察凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有 DNA 断裂，因而没有 3-OH 形成， 很少能够被染色。本试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样 本（细胞涂片）在单细胞水平上的凋亡原位检测。还可应用于抗肿瘤药的药效评价， 以及通过双色法确定细胞死亡类型和分化阶段。二、器材与试剂 器材：光学显微镜及其成像系统、小型染色缸、湿盒（塑料饭盒与纱布）、塑料盖玻 片或封口膜、吸管、各种规格的加样器及枪头等；试剂：试剂盒含TdT 10x、荧光素标记的d

3、UTP lx、标记荧光素抗体的HRP;自备试剂： PBS、双蒸水、二甲苯、梯度乙醇（100、95、90、80、70%）、DAB工作液（临用前配 制，5 pl 20xDAB+1yL 30%H202+94 pl PBS）、Proteinase K 工作液（10-20 yg/ml in 10 mMTris/HCl, pH 7.4-8 ）或细胞通透液（0.1% Tri ton XT00 in 0.1% sodium c it ra te, 临用前配制）、苏木素或甲基绿、DNase 1 （3000 U/ml- 3 U/ml in 50 mM Tris-HCl， pH 7.5， 10 mM MgCl2，1

4、 mg/ml BSA）等。三、实验步骤操作流程图：制作石蜡切片T脱蜡、水合T细胞通透T加TUNEL反应液T加converter-PODt与底物DAB反应显色t光学显微镜计数并拍照。具体操作步骤：1. 用二甲苯浸洗 2 次，每次 5min；2. 用梯度乙醇（100、95、90、80、70%）各浸洗 1 次，每次 3min；3. PBS 漂洗 2 次；4. 用Proteinase I工作液处理组织15-30 min 在21-37C （温度、时间、浓度均需摸索）或者加细胞通透液 8min；5. PBS 漂洗 2 次；6. 制备TUNEL反应混合液，处理组用50yl TdT+450卩l荧光素标记的dU

5、TP液混匀；而 阴性对照组仅加50卩l 荧光素标记的dUTP液，阳性对照组先加入100卩l DNase 1，反 应在1525Cx10min, 后面步骤同处理组。7. 玻片干后，加50卩l TUNEL反应混合液（阴性对照组仅加50卩l荧光素标记的dUTP 液）于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37Cx1ho8. PBS 漂洗 3 次；9. 可以加1滴PBS在荧光显微镜下计数凋亡细胞（激发光波长为450500nm，检测波 长为 515565nm）；10. 玻片干后加50卩l converter-POD于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应 37Cx30mino11. PBS漂洗3次；12.

6、 在组织处加 50100ylDAB 底物，反应 1525Cx10min ;13. PBS漂洗3次；14. 拍照后再用苏木素或甲基绿复染，几秒后立即用自来水冲洗。梯度酒精脱水、二 甲苯透明、中性树胶封片。15. 加一滴PBS或甘油在视野下，用光学显微镜观察凋亡细胞（共计200500个细胞） 并拍照。可结合凋亡细胞形态特征来综合判断（未染色细胞变小，胞膜完整但出现发 泡现象，晚期出现凋亡小体，贴壁细胞出现邹缩、变圆、脱落；而染色细胞呈现染色 质浓缩、边缘化，核膜裂解，染色质分割成块状/凋亡小体）四、注意事项1. 进行 PBS 清洗时，每次清洗 5 mino2. PBS清洗后，为了各种反应的有效进行

7、，请尽量除去PBS 溶液后再进行下一步反应。3. 在载玻片上的样本上加上实验用反应液后，请盖上盖玻片或保鲜膜，或在湿盒中进 行，这样可以使反应液均匀分布于样本整体，又可以防止反应液干燥造成实验失败。4. TUNEL 反应液临用前配制，短时间在冰上保存。不宜长期保存，长期保存会导酶活 性的失活。5. 如果20XDAB溶液颜色变深成为紫色，则不可使用，需重新配制。6. 用 甲基绿（Methyl Green）染液（3-5%甲基绿溶于0.1M 醋酸巴比妥 PH4.0）染色 后，请用灭菌蒸馏水清洗多余的甲基绿。然后进行洗净（ 1 0 0%乙醇） 、脱水（二甲苯） 透明、封片后通过光学显微镜观察操作。如果此时使用 8090%的乙醇洗净时，甲基绿 比较容易脱色，注意快速进行脱水操作。7. 荧光素标记的 dUTP 液含甲次砷酸盐和二氯钴等致癌物，可通过吸入、口服等途径 进入机体，注意防护。8. 试剂保存；未打开的试剂