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1、赵志杰，史国安，董新纯编的植物生理学实验指导）参考陈建勋，王晓峰主编的植物生理学实验指导,P2729硝酸还原酶活性的测定原理硝酸还原酶是植物氮素代谢作用中关键性酶，与作物吸收和利用氮 简单易行，在一般条件下都能做到。红色的偶氮染料。反应液的酸度大则增加重氮化作用的速度，但降低偶联作用的 速度，颜色比较稳定。增加温度可以增加反应速度，但降低重氮盐的稳定度，所 以反应需要在相同条件下进行。这种方法非常灵敏，能测定每ml含0.5“g的 NaNO2。仪器药品721 型分光光度计 真空泵（或注射器）天平保温箱真空干燥器钻孔器三角烧瓶 移液管烧杯O.1mol/L磷酸缓冲液，pH7.5 (见附表2)。0.2
2、mol/L KN03:溶解 20.22g KN03 于 1000ml 蒸馏水中。磺胺试剂：1g磺胺加25ml浓盐酸，用蒸馏水稀释至100ml。a萘胺试剂：0.2ga萘胺溶于含1ml浓盐酸的蒸馏水中，稀释至100ml。NaNO2标准溶液：1g NaNO2用蒸馏水溶解成1000ml。然后吸取5ml，再加 蒸馏水稀释成1000ml，此溶液每ml含有NaNO2 5pg，用时稀释之。操作步骤1. 将新鲜取回的叶片(蓖麻、烟草、向日葵、油菜、小麦、棉花等均可) 水洗，用吸水纸吸干，然后用钻孔器钻成直径约1cm的圆片，用蒸馏水洗涤2 梍3次，吸干水分，然后于台天平上称取等重的叶子圆片两份，每份约0.30.4
3、g (或每份取50个圆片)，分别置于含有下列溶液的50ml三角烧瓶中：(1)0.1mol/L 磷酸缓冲溶液(pH7.5)5ml+蒸馏水5ml ； (2)0.1mol/L磷酸缓冲溶液 (pH7.5)5ml+0.2mol/L KNO3 5ml。然后将三角烧瓶置于真空干燥器中，接上真 空泵抽气，放气后，圆片即沉于溶液中(如果没有真空泵，也可以用20ml注射 器代替，将反应液及叶子圆片一起倒入注射器中，用手指堵住注射器出口小孔， 然后用力拉注射器使真空，如此抽气放气反复进行多次，即可使圆片中的空气抽 去而沉于溶液中)。将三角烧瓶置于30C温箱中，使不见光，保温作用30分钟, 然后分别吸注意取样前叶子要
4、进行一段时间的光合作用，以积累碳水化合物，如果组织中 的碳水化合物含量低，会使得酶的活性降低，此时则可于反应溶液中加入 30pg3磷酸甘油醛或1, 6二磷酸果糖，能显著增加保温30分钟结束时,吸取反应溶液1ml于一试管中,加入磺胺试剂2ml及a 萘胺试剂2ml，混合摇匀，静置30分钟，用比色计进行比色测3. 绘制标准曲线与重氮化作用及偶联作用的速度有关，温度、酸浓度等都影响显色速度，同时也 影响灵敏度，但如果标准与样品的测定都在相同条件下进行，则显色速度相同， 彼此可以比较。吸取不同浓度的NaN02溶液（例如5、4、3、2、1、0.5g/ml） 1ml于试管 中，加入磺胺试剂2ml及a萘胺试剂
5、2ml，混合摇匀，静置30分钟（或于一 定温度的水俗中保温30分钟），立即于分光光度计中进行测定，测定时的波长 为520nm,比色，读取吸光度或透光率。然后，以吸光度为纵坐标，NaN02浓 度为横坐标。于毫米方格纸上绘制吸光度浓度曲线。实验作业1试比较不同植物的酶活性。2试比较取样前植物处于照光或黑暗条件下酶活性的不同。参考文献1陈薇、张德颐：1980。植物组织中硝酸还原酶的提取测定和纯化，植物生 理学通讯，1980(4)：4549。2周树、郑相穆：1985。硝酸还原酶体内分析方法的探讨，植物生理学通讯， 1985(1)：4749。3Hageman,R.H.and D.P. Hucklesby
6、:1971.Methods in Enzymology,23A:491503.4Radin.J.W.:1973.Plant Physiology,51:332336.5Snell,F.D.and C.T.Snell:1949.Colorimetric Methods of Analysis,Vol.II,802807硝酸还原酶(NR)的测定采用离体法：(1g样)(参考陈建勋，王晓峰主编的植 物生理学实验指导,P2729)亚硝酸钠标准溶液(1pg/ml):称NaN02 0.9857g，定容到1000ml，再吸5ml 定容到 1000ml。0.1 mol/L pH7.5 的磷酸缓冲溶液：30.09
7、05g Na2HPO4 12H2O + 2.4965g NaH2PO42H2O，加蒸馏水定容到1000ml。3mol/L HCl: 125ml浓盐酸加蒸馏水定容到500ml。1 %磺胺溶液：5.0g磺胺溶于500ml 3mol/L HCl中。0.2% a-萘胺溶液：1.0g a-萘胺溶于125ml冰醋酸后用蒸馏水定容到500ml,贮 于棕色瓶中。0.1mol/L KNO3 溶液：5.055g KNO3 溶于 500mln 0.1 mol/L pH7.5 的磷酸缓冲 溶液。0.025mol/L pH8.7 的磷酸缓冲溶液：Na2HPO4 12H2O 8.8640g + NaH2PO42H2O 0
8、.0570g，加蒸馏水定容到1L。提取缓冲液：1.211g半胱氨酸+ 0.372g EDTA,溶于1L 0.025 mol/L pH8.7的 磷酸缓冲溶液。2mg/ml NADH 溶液：0.5g NADH 溶于 250ml 0.1 mol/L pH7.5 的磷酸缓冲溶液 （临用前配制）。首先标制作准曲线:取7支洁净烘干的15ml刻度试管加试剂，即配成02.0pg的系列标准亚硝态 氮溶液。摇匀后在30C保温箱或恒温水浴中保温30min,然后在540nm波长下 比色。以亚硝态氮（pg）为横坐标（x）,光密度值为纵坐标（y）绘标准曲线 或建立回归方程。各试剂加入顺序 管号1亚硝酸钠标准液(ml)00
9、.20.40.81.21.62.0蒸馏水(ml)2.01.81.61.20.80.401%磺胺溶液(ml)44444440.2%a-萘胺(ml)4444444每管含N02- (pg)00.20.40.81.21.62.01g材料+15ml提取缓冲液后研磨匀浆，转移到离心管中于4C、4000r/min下 离心15mi n,上清液即为粗酶提取液，用于硝酸还原酶(NR )的测定。0.4ml+1.2ml O.1mol/L KN03 溶液 + 0.4mlNADH 溶液后混匀(对照不加 NADH 溶液，而以0.4ml 0.1mol/L pH 7.5磷酸缓冲液代替)，在25C水浴中保温30min。 保温结束后立即加入1ml磺胺溶液终止酶反应，再加1ml 0.2% a-萘胺溶液，显 色反应15min后于4000r/min下离心5min,取上清液在540nm下比色测定吸 光度。根据回归方程计算。
硝酸还原酶活性的测定
