巨噬细胞的原代培养

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1、1 原理 巨噬细胞属天然免疫细胞，具有趋化运动、吞噬、分泌和参与免疫调节等功能，是 科学工作者研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。巨噬细胞容易获得，便于培 养，并可进行纯化。巨噬细胞属不繁殖细胞群，在条件适宜下可生活23 周多用做原代培 养，不易长期生存。 巨噬细胞也建有无限细胞系，大多来自小鼠，如 P331、S774A.1、 RAW309Cr.l 等，均获恶性，培养中呈巨噬细胞形态和吞噬功能，易于传代和瓶壁分离，但 难以建株。目前，单核巨噬细胞株也有，比如RAW264.7,但价格比较贵，且保存也不方便。 培养巨噬细胞可用各样方法和各种来源来获取细胞，目前以小鼠腹腔取材法最为实用，而

2、目 前获取小鼠巨噬细胞的方法有两种，一种是直接用培养液灌洗实验动物腹腔，从腹腔灌洗液 中分离巨噬细胞，还有一种方法向动物腹腔中注射刺激物(如牛血清，淀粉，糖原，脂多糖， 矿物油， PRMI1640 培养液等)，这样使机体产生大量巨噬细胞后再腹腔灌洗，但由于许多 刺激物能激活巨噬细胞，而被激活的巨噬细胞大量吞噬刺激物，有此得到的巨噬细胞培养用 于培养时，细胞中的刺激物不能很快被消化而残留在细胞中，影响细胞代谢，同时也不能很 好的模拟体内环境，所以我们直接用培养液灌洗实验动物腹腔，从腹腔灌洗液中分离巨噬细 胞。我们选择6周龄的昆明小鼠是因为此年龄小鼠能产生最多的巨噬细胞。2 试验材料昆明种小鼠10

3、只体重约18g25g (约6周龄)由广西医科大学动物实验中心提供 公鸡 1 只PRMI1640培养基新生小牛血清HEPESD-Hanks 液青霉素 链霉素3 试验仪器无菌操作台 手术刀 解剖剪 解剖镊 止血钳 5m 注射器 注射针，试管、培养瓶(12)， 12 孔培养板(12)等。二氧化碳培养箱生物显微镜高速冷冻离心机低温冰箱4 实验步骤41 细胞培养液的制备及消毒制备方法:将RPMI1640干粉一袋，HEPES4. 77g加入800m1三蒸水中，充分溶解后缓慢加入碳酸氢 钠并逐步添加三蒸水，使溶液的pH值处于7. 2-7. 4之间，容积为1000m1。鸡红细胞悬液制备:按无菌操作,自鸡翼下静

4、脉采血,立即置入盛有五倍于取血量的 1%肝素 抗凝剂的三角烧瓶中，混匀,4C冰箱内保存。使用前，以无菌生理盐水离心洗涤3次，前一次离 心速度为1500r/min,离心5分钟,弃上清液和界面粒细胞层,最后连续离心2次(2000r/min,5 分钟),用生理盐水配成1%鸡红细胞悬液备用。培养液的无菌处理：将0.45微米和0.22微米的微孔滤膜浸过三蒸水，与zeiss过滤装置所需的清洁不锈钢筒、 钢筛、胶管安装好，并高压灭菌。(2)在净化室内，打开己消毒的zeiss抽滤器，将配制好的RPMI1640培养液进行过滤，开将 过滤后的RPMI1640培养液分装，置入4C冰箱中备用。（3）将新生小牛血清20

5、0m1,在56C水浴中灭活30分钟，按10%的浓度分别加入培养液中 备用。42 巨噬细胞的获取4.2.1 以颈椎脱臼法处死小鼠。4.2.2手提鼠尾将其全浸入 75%乙醇中5min,倒立小鼠并向腹腔内注射预冷至 4C PRMI1640培养液5ml（注意针尖勿伤及内脏），仰卧平放并轻揉小鼠腹部23min,静置5 7min。4.2.3 置小鼠于解剖台，用针头固定四肢，在腹股沟区作一横切口，撕裂皮肤以完全暴露出 腹膜壁， 但勿伤及腹膜壁。用 75%酒精冲洗腹膜壁4.2.4 用手指从两侧压揉腹膜壁，使液体在腹腔内流动，并 促使巨噬细胞从腹腔的浆膜表 面释放，形成细胞悬液。4.2.5用针头轻挑起腹壁并微倾

6、向一侧使腹腔中液体集中于针头下吸取入针管内。 4.2.6小心拔出针头，把腹腔液注入预冷的培养瓶内。4.2.7常规计数细胞。每只鼠可产生2 3x106/ml细胞，其中90%为巨噬细胞。取少量细 胞悬液做 Giemsa 染色,在光镜下观察以鉴定是否是巨噬细胞。4.3巨噬细胞的纯化将细胞悬液于4C、1000r/min离心10min,弃上清，放入培养瓶中，将培养瓶中细胞用4C D-Hanks液洗2次，再用RPMI1640培养液于37C、5% CO2下培养2h,弃上清，用D-Hanks 液洗涤2次以洗去未贴壁细胞,贴壁的细胞则主要是巨噬细胞。然后换下培养用含10小牛 血清的RPMI 1640培养液培养继

7、续培养，此时将得到接近纯净的巨噬细胞。4.4巨噬细胞的接种和培养将纯化的巨噬细胞培养瓶快速冷冻至2C,待细胞收缩后猛摇或吹打培养瓶，使巨噬细胞从 瓶壁上脱落下来（Castranova et al.1996）。制成细胞悬液后，计数并调节细胞密度。以 2x1054x105个/cm2的密度接种细胞于12孔培养板内，加入适量RPMI1640培养液后 置于37C、5% CO2、饱和湿度的培养箱中培养，每两天换一次液，以备用。4.5巨噬细胞的鉴定取培养板内任意一孔细胞用Gomori酸性磷酸酶（ACP）铅法染色，细胞呈阳性反应，ACP 活性颗粒呈棕黑色，则可以断断是巨噬细胞，光镜下计数200个细胞求出阳性率。 4.6巨噬细胞吞噬功能的检测:在巨噬细胞接种和培养过程中，取适量巨噬细胞悬液放入培养瓶中，加入 1%鸡红细胞悬 液,37C孵育2h，甲醇固定细胞涂片，吉姆萨染色，显微镜下观察巨噬细胞吞噬鸡红细胞情况。 计数100个巨噬细胞,计算吞噬率和吞噬指数。吞噬率=吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数/100（所观察的巨噬细胞数） x100%。 吞噬指数=100个巨噬细胞吞噬的鸡红细胞总数/100（所观察的巨噬细胞数）。