《核酸序列分析》PPT课件.ppt

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1、第 四 章 核 酸 序 列 分 析 4.1 DNA序 列 分 析 和 基 因 结 构vDNA序 列 分 析 的 目 的 意 义 在 DNA序 列 中 ， 除 了 基 因 之 外 ， 还 包 含 许 多 其 它 信 息 ， 这 些 信 息 大 部分 与 核 酸 的 结 构 特 征 相 关 联 ， 通 常 决 定 了 DNA与 蛋 白 质 或 者 DNA与 RNA的 相 互 作 用 。 存 放 这 些 信 息 的 DNA片 段 称 为 功 能 位 点 ， 如 启 动 子（ Promoter） 、 基 因 终 止 序 列 （ Terminator sequence） 、 剪 切 位 点 （ Spli

2、ce site） 等 。 DNA序 列 分 析 就 是 在 获 得 DNA原 始 序 列 的 基 础 上 ， 快 速 寻 找 基 因 ， 找出 基 因 的 位 置 及 其 功 能 位 点 ， 这 对 于 基 因 的 结 构 和 功 能 研 究 ， 揭 示 生 命 奥秘 具 有 重 要 意 义 。 UTR， 非 翻 译 区 域 （ untranslated regions）v基 因 结 构原 核 生 物 基 因 结 构 真 核 生 物 基 因 结 构基 因 不 连 续 性 ： 基 因 的 编 码 序 列 在 DNA分 子 上 是 被 不 编 码 的 序 列 隔 开 而 不 连 续 排 列 ， 绝

3、 大 多 数 真 核 生 物 基 因 是 不 连 续 的 ， 由 内 含 子 （ intron） 和 外 显 子 （ exon） 组 成 。 发 现 重 复 元 素数 据 库 搜 索分 析 功 能 位 点综 合 分 析v基 本 的 DNA序 列 分 析 方 案 遮 蔽 重 复 序 列 序 列 重 复 现 象 在 原 核 、 真 核 生 物 DNA中 都 存 在 ， 真 核 生 物 更 普 遍 。有 种 属 特 异 性 ， 基 因 组 越 大 重 复 序 列 含 量 越 丰 富 。 分 为 轻 度 重 复 序 列 、中 度 重 复 序 列 、 高 度 重 复 序 列 等 类 型 。 一 般 来

4、说 ， 在 进 行 任 何 DNA序 列 的 基 因 分 析 之 前 ,最 好 把 散 布 和 简 单的 重 复 序 列 找 出 来 并 从 序 列 中 除 去 。 虽 然 这 些 重 复 序 列 可 能 正 好 覆 盖 了由 RNA聚 合 酶 转 录 的 部 分 区 域 ， 它 们 几 乎 不 会 覆 盖 启 动 子 和 外 显 子 编码 区 。 重 复 序 列 还 常 常 会 搅 乱 其 它 分 析 ， 特 别 是 在 数 据 库 搜 索 中 ， 由 于重 复 序 列 的 存 在 ， 可 能 得 到 许 多 同 样 的 结 果 ， 这 些 结 果 的 得 分 很 高 ， 使解 释 数 据

5、库 搜 索 结 果 变 得 复 杂 、 困 难 。 o 相 关 资 源CENSOR http:/www.girinst.org/censor/RepeatMasker http:/www.repeatmasker.org/cgi-bin/ WEBRepeatMasker Repbase http:/www.girinst.org/index.html 这 些 网 站 上 的 在 线 程 序 可 帮 助 识 别 并 去 除 重 复 序 列 。 同 源 性 检 索 一 般 来 说 ， 数 据 库 相 似 性 搜 索 是 进 行 基 因 辨 识 的 最 初 手 段 ， 也 是DNA序 列 分 析 的

6、 最 基 本 步 骤 。 在 同 源 性 检 索 中 ， 通 过 查 询 DNA数 据 库 来 判 断 查 询 序 列 是 否 与 已 知基 因 的 序 列 相 同 或 相 似 。 例 如 ， 如 果 通 过 搜 索 发 现 待 分 析 的 序 列 与 已 知 蛋 白 质 编 码 序 列 相 似 ，则 可 以 推 测 待 分 析 的 序 列 是 基 因 序 列 。 基 因 分 析q序 列 翻 译 与 开 放 阅 读 框 （ ORF） 预 测序 列 翻 译 指 利 用 计 算 机 程 序 将 核 酸 序 列 按 照 三 联 体 密 码 规 则 翻 译 成 蛋 白质 序 列 ， 还 可 以 将 氨

7、 基 酸 序 列 倒 翻 成 核 酸 序 列 。阅 读 框 （ reading frames） 对 于 任 何 给 定 的 单 链 核 酸 序 列 ， 根 据 密 码 子 的 起 始 位 置 ， 可 以按 照 三 种 方 式 进 行 解 释 ， 这 三 种 阅 读 顺 序 称 为 阅 读 框 。 双链DNA序列有6个可读框 开 放 阅 读 框 （ open reading frames， O RF） 以 起 始 密 码 子 （ 通 常 为 ATG） 开 始 ， 以 终 止 密 码 子 （ TAA、 TGA或TAG） 结 束 （ 但 不 包 括 终 止 密 码 子 ） ， 中 间 由 一 系 列

8、 密 码 子 组 成 的 序 列区 域 ， 它 决 定 了 所 编 码 蛋 白 质 的 氨 基 酸 顺 序 。 DNA序 列 分 析 中 基 因 识 别 的 目 的 之 一 就 是 进 行 开 放 阅 读 框 （ ORF） 的寻 找 和 预 测 。 O RF辨 别 的 基 本 方 法 （ 1） 利 用 编 码 区 所 具 有 的 独 特 信 号 ， 比 如 起 始 密 码 子 、 终 止 密 码 子 等 进 行识 别 检 查 终 止 密 码 子 的 出 现 频 率 基 本 思 想 ： 如 果 能 够 找 到 一 个 比 较 长 的 序 列 ， 其 相 应 的 密 码 子 序 列 不 含 终 止

9、 密 码子 ， 则 这 段 序 列 可 能 就 是 编 码 区 域 。基 本 算 法 ： 扫 描 给 定 的 DNA序 列 ， 在 三 个 不 同 的 阅 读 框 中 寻 找 较 长 的 ORF。 遇 到终 止 密 码 子 以 后 ， 回 头 寻 找 起 始 密 码 子 。 这 种 算 法 过 于 简 单 ， 不 适 合 于 处 理 短 的 ORF或 者 交 叠 的 ORF。 分 析 各 种 密 码 子 出 现 的 频 率 基 本 思 想 ： 每 种 氨 基 酸 是 由 相 应 个 数 密 码 子 编 码 的 ， 例 如 ， 亮 氨 酸 、 丙 氨 酸 、 色 氨酸 分 别 有 6个 、 4个

10、 和 1个 密 码 子 。 将 一 个 随 机 均 匀 分 布 的 DNA序 列 翻 译成 氨 基 酸 序 列 ， 理 论 上 说 各 氨 基 酸 在 序 列 中 出 现 的 比 例 应 该 符 合 氨 基 酸的 密 码 子 数 目 ， 如 上 述 3种 氨 基 酸 出 现 的 比 例 应 该 为 6:4:1。 但 是 在 真 实的 氨 基 酸 序 列 中 ， 上 述 比 例 并 不 正 确 ， 这 说 明 DNA的 编 码 区 域 并 非 随 机 。基 本 算 法 ： 假 设 在 一 条 DNA序 列 中 已 经 找 到 所 有 的 ORF， 那 么 可 以 利 用 密 码 子 频 率进 一

11、 步 区 分 编 码 ORF和 非 编 码 ORF， 利 用 这 种 方 法 ， 可 以 计 算 一 个 ORF 成 为 编 码 区 域 的 可 能 性 。 （ 2） 利 用 编 码 区 与 非 编 码 区 的 碱 基 组 成 不 同 进 行 识 别 由 于 蛋 白 质 中 20种 氨 基 酸 出 现 的 概 率 不 同 ， 每 种 氨 基 酸 的 密 码 子 兼 并度 不 同 ， 同 一 种 氨 基 酸 的 兼 并 密 码 子 使 用 频 率 不 同 等 原 因 ， 造 成 单 个 碱基 的 组 成 比 例 和 多 个 碱 基 的 组 成 方 式 在 不 同 的 物 种 中 呈 现 出 不

12、同 的 规 律 。因 此 ， 可 通 过 统 计 分 析 识 别 编 码 序 列 。 （ 3） 利 用 经 验 规 律 进 行 识 别o 若 在 起 始 密 码 子 上 游 发 现 了 核 糖 体 结 合 位 点 ， 则 可 肯 定 找 到 一 个 ORF。o 利 用 Kozak规 则 识 别 翻 译 起 始 位 点 Kozak规 则 是 研 究 第 一 个 ATG侧 翼 序 列 的 碱 基 分 布 所 满 足 的 统 计 规 律 ，若 将 第 一 个 ATG中 的 碱 基 A， T， G分 别 标 为 1， 2， 3位 ， 则 Kozak规 则 可描 述 如 下 ： 第 4位 的 偏 好 碱

13、 基 为 G； ATG的 5端 约 15bp范 围 的 侧 翼 序 列 内 不 含 碱 基 T； 在 -3， -6和 -9位 置 ， G是 偏 好 碱 基 ； 除 -3， -6和 -9位 ， 在 整 个 侧 翼 序 列 区 ， C是 偏 好 碱 基 。Kozak规 则 是 基 于 已 知 数 据 的 统 计 结 果 ， 不 见 得 必 须 全 部 满 足 ， 一 般 来 说 ，满 足 前 两 项 即 可 。 应 用 程 序 ORF finder （ http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html） 简 单 的 在 线 基 因 查 找 程 序 ， 可 对 任

14、何 序 列 执 行 6个 可 读 框 的 翻 译 ， 用户 可 自 由 选 择 义 多 肽 的 最 小 长 度 和 所 用 的 遗 传 编 码 规 则 。 主 要 适 合 寻找 基 因 分 布 密 集 并 且 无 内 含 子 的 核 酸 序 列 。 GetOrf （ http:/bioweb.pasteur.fr/seqanal/interfaces/getorf.html） Plotorf （ http:/mobyle.pasteur.fr/cgi-bin/portal.py?form=plotorf） GENSCAN商 业 软 件 基 本 思 路 ：找 出 基 因 两 端 的 功 能 区

15、域 : 转 录 启 动 区 （ 启 动 子 ） 、 终 止 区 在 启 动 区 下 游 位 置 寻 找 翻 译 起 始 密 码 子 转 录 剪 切 分 析q探 查 DNA中 的 功 能 性 位 点启 动 子 分 析 启 动 子 是 DNA分 子 可 以 与 RNA聚 合 酶 特 异 结 合 的 部 位 ， 也 就 是 使 转 录 开 始 的部 位 。 识 别 出 启 动 子 对 于 基 因 辨 识 十 分 重 要 ， 启 动 子 一 般 可 分 为 两 类 : (1)一 类 是 RNA聚 合 酶 可 以 直 接 识 别 的 启 动 子 。(2)另 一 类 启 动 子 在 和 聚 合 酶 结 和

16、 时 需 要 有 蛋 白 质 辅 助 因 子 （ 转 录 因 子 ） 的 存 在 。 启 动 子 分 析 方 法 ：利 用 模 型 描 述 几 种 转 录 因 子 结 合 部 位 定 向 及 其 侧 翼 结 构 特 点 ， 然 后 进 行 其 它 DNA序 列 的 启 动 子 预 测 的 启 发 式 方 法 ；根 据 启 动 子 与 转 录 因 子 结 合 的 特 性 ， 从 转 录 因 子 结 合 部 位 的 密 度 推 测 出 启 动 子 区域 ， 这 方 法 存 在 较 高 的 假 阳 性 ；根 据 启 动 子 区 自 身 的 特 征 来 进 行 测 定 ， 这 种 方 法 的 准 确

17、性 比 较 高 。 同 时 ， 还 可 以结 合 是 否 存 在 CpG岛 ， 而 对 启 动 子 预 测 的 准 确 性 做 出 辅 助 性 的 推 测 。启 动 子 预 测 软 件 有 ： PromoterScan ; Promoter 2.0 ; NNPP ;EMBOSS Cpgplot ; CpG Prediction (From:http:/ http:/bip.weizmann.ac.il/toolbox/seq_analysis/promoters.html#databaseshttp:/www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.htmlhttp:/

18、sdmc.lit.org.sg/promoter/CGrich1_0/CGRICH.htmhttp:/www.gene- 内 含 子 剪 接 位 点 的 识 别 选 择 性 剪 接 是 指 选 择 性 地 对 前 体 mRNA不 同 的 剪 接 位 点 的 组 合 的 剪 接 方 式 。通 过 选 择 性 剪 接 ， 由 一 条 前 体 mRNA可 生 成 多 条 的 成 熟 mRNA。 剪 接 连 接 点 是 指 在 切 断 和 重 接 位 点 处 的 两 旁 的 顺 序 。GT-AG法 则 ： 所 有 内 含 子 序 列 5 端 起 始 的 两 个 核 苷 酸 总 是 GT， 3端 的 最

19、 后 两个 核 苷 酸 始 终 是 AG ， 这 就 是 RNA剪 接 的 信 号 。基 本 思 路 ：(1) 寻 找 基 因 剪 切 位 点 ， 形 成 外 显 子 和 内 含 子 的 边 界 剪 切 给 体 （ donor） 位 点 - “GT” 受 体 （ acceptor） 位 点 - “AG” (2) 搜 集 候 选 外 显 子 ， 连 接 形 成 候 选 基 因 候 选 基 因 位 于 给 定 的 DNA序 列 ， 并 满 足 下 列 一 致 性 条 件 ： a 所 有 外 显 子 加 起 来 的 长 度 是 3的 整 数 倍 ； b 在 各 个 外 显 子 内 部 （ 除 最 后

20、 一 个 外 显 子 的 最 后 一 个 密 码 子 ） ， 没 有 终 止 编 码 ； c 第 一 个 内 含 子 -外 显 子 边 界 是 翻 译 起 始 编 码 ， 而 最 后 一 个 外 显 子 -内 含 子 边 界 是 终止 编 码 。(3) 构 建 位 点 图 从 起 点 到 终 点 的 任 何 一 条 路 径 代 表 一 个 可 能 的 基 因 结 构 。 (4) 求 最 优 路 径 计 算 外 显 子 、 内 含 子 度 量 ， 赋 予 每 一 条 子 途 径 一 个 权 值 ； 计 算 剪 切 位 点度 量 ， 赋 予 每 个 节 点 权 值 。 利 用 DNA、 RNA和

21、蛋 白 质 数 据 库 中 的 同 源 信 息 进 行 搜 索 ， 寻 找 相 似 体 ，从 而 综 合 评 价 出 最 可 能 的 外 显 子 组 合 。 软 件 网 址 说 明GRAIL http:/compbio.ornl.gov/Grail-1.3 分 析 范 围 主 要 包 括 人 、 小 鼠 、 果蝇 、 拟 南 芥 、 大 肠 杆 菌GeneSplicer http:/www.tigr.org/tdb/ GeneSplicer/gene_spl.html 分 析 范 围 主 要 包 括 人 、 果 蝇 、 拟南 芥 、 疟 疾 、 水 稻NetGene2 http:/www.cb

22、s.dtu.dk/services/NetGene2/ 可 对 基 因 序 列 片 段 进 行 预 测Tiger Combiner http:/www.tigr.org/software 综 合 3种 以 上 预 测 方 法 ， 用 于Unix系 统BCM Gene Finder http:/www.bioscience.org/urllists/genefind.htm 在 线 分 析 7000bp序 列 ， 大 于 此长 度 的 可 通 过 E-mail进 行 分 析 IDB http:/nutmeg.bio.indiana.edu/intro/index.html 内 含 子 序 列 数

23、 据 库ExInt http:/intro.bic.nus.edu.sg/ 外 显 子 和 内 含 子 数 据 库Intronerator http:/www.soe.ucsc.edu/kent/intronerator C.Elegans的 内 含 子 和 选 择 性 剪 接基 因 的 数 据 库GenScan http:/genes.mit.edu/GENSCAN.html 基因搜索及内含子分析相关资源 q 其 它 基 因 分 析 方 法 EST策 略 的 电 子 克 隆 表 达 序 列 标 签 （ Expressed Sequence Tag， EST） 是 从 一 个 随 机 选 择

24、的 cDNA 克 隆 进 行 5端 和 3端 单 一 次 测 序 获 得 的 短 的 cDNA 部 分 序 列 ， 代 表 一 个 完 整 基 因的 一 小 部 分 ， 一 般 长 200-600个 核 苷 酸 对 。 一 个 全 长 的 cDNA分 子 可 以 有 许 多 个 EST， 但 特 定 的 EST有 时 可 以 代 表 某 个 特定 的 cDNA分 子 。 首 先 对 获 得 的 EST数 据 进 行 同 源 性 性 分 析 ， 两 端 有 重 叠 的 共 有序 列 的 EST可 以 组 装 成 一 个 叠 连 群 ， 直 到 装 配 成 全 长 的 cDNA序 列 ， 然 后

25、再 进 行ORF和 相 关 功 能 位 点 的 判 定 ， 这 样 就 等 于 是 克 隆 了 一 个 基 因 的 编 码 序 列 。 还 可 以将 EST作 为 一 种 标 记 序 列 定 位 在 基 因 组 ， 从 而 明 确 这 个 cDNA的 基 因 组 结 构 ， 包括 外 显 子 、 内 含 子 等 。EST数 据 库 ： http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST/ 基 因 分 析 方 法 存 在 的 问 题 ：（ 1） 目 前 的 方 法 仅 仅 识 别 蛋 白 质 编 码 基 因 转 录 信 号（ 2） 现 有 的 许 多 方 法 仅 检 测 单 个 基

26、 因部 分 基 因 、 多 重 基 因 （ 3） 基 于 同 源 分 析 的 方 法 是 保 守 的不 可 能 发 现 新 的 基 因 （ 4） 忽 视 关 于 基 因 结 构 的 生 物 学 知 识基 因 表 达 的 真 实 分 子 机 制 v常 用 的 基 因 分 析 软 件 商 业 软 件 包 GCG与 Staden同 属 软 件 包 ， 就 是 大 量 单 个 完 成 不 同 功 能 的 软 件 的 集 合 。使 用 时 ， 单 个 软 件 可 以 互 相 调 用 、 协 同 工 作 ， 也 可 以 只 使 用 单 一 一 个 软件 完 成 某 项 操 作 。 GCG和 Staden都

27、 可 执 行 数 百 种 任 务 ， 如 序 列 比 对 ， 数 据库 搜 索 和 查 询 ， 研 究 生 物 进 化 ， 序 列 装 配 ， 寻 找 基 因 及 模 式 识 别 ， RNA指 纹 及 限 制 性 内 切 酶 图 谱 ， 引 物 设 计 ， 蛋 白 质 motif分 析 ， DNA/RNA二 级结 构 分 析 ， 翻 译 等 等 。 GCG与 Staden的 主 要 区 别 就 在 于 ， GCG有 网 络 功 能 ，用 户 不 必 在 其 本 地 机 上 装 载 GCG。 而 Staden到 目 前 为 止 还 不 支 持 网 络 用 户 。 免 费 软 件 包（ 1） 同

28、源 性 搜 索 BLAST、 FASTA（ 2） 未 知 序 列 分 析 软 件重 复 序 列 分 析 CENSOR、 RepeatMasker编 码 区 统 计 特 性 分 析 工 具 常 见 的 编 码 区 统 计 特 性 分 析 工 具 将 多 种 统 计 分 析 技 术 组 合 起 来 ， 给 出 对 编 码 区的 综 合 判 别 。 著 名 的 程 序 有 GRAIL和 GenMark等 ， GRAIL提 供 了 基 于 Web的 服 务 。网 址 是 ： http:/compbio.ornl.gov/Grail-1.3/剪 接 位 点 分 析 GENESCAN、 NetGene 翻

29、 译 起 始 /终 止 位 点 分 析 对 于 真 核 生 物 ， 如 果 已 知 转 录 起 始 点 ， 并 且 没 有 内 含 子 打 断 5非 翻 译 区 的 话 ，“ Kozak规 则 ” 可 以 在 大 多 数 情 况 下 定 位 起 始 密 码 子 。 对 于 原 核 生 物 ， 关 键 是 核 糖体 结 合 点 的 定 位 ， 可 根 据 Shine-Dalgarno序 列 的 特 点 进 行 。 PolyA和 翻 译 终 止 信 号 不 象 起 始 信 号 那 么 重 要 ， 但 也 可 以 辅 助 划 分 基 因 的 范 围 。 启 动 子 识 别 识 别 出 启 动 子 对

30、 于 基 因 辨 识 十 分 重 要 。 常 用 软 件 有 Promoter Scan II 、PromoterInspector 、 Dragon Promoter Finder 等 。 但 是 预 测 过 程 中 遗 漏 和 假 阳 性 都比 较 严 重 ， 仍 需 挖 掘 新 的 算 法 和 软 件 。tRNA基 因 的 识 别 tRNA基 因 识 别 比 编 码 蛋 白 质 的 基 因 识 别 简 单 ， 常 用 工 具 tRNAscan-SE (http:/www.genetics.wustl.edu/eddy/tRNAscan-SE/)。 常 用 工 具 软 件 EBI整 理 的

31、 生 物 软 件 目 录 biocatalog (http:/www.biocatalogue.org/)， 包 含 有 近 千 个软 件 ， 其 中 包 括 常 用 的 引 物 设 计 软 件 Primer Premier和 酶 切 位 点 设 计 软 件 WEBcutter等 ， 基 本 上 是 最 全 的 专 业 软 件 目 录 。 引 物 设 计 软 件原 理 引 物 通 常 是 指 与 模 版 DNA的 特 定 位 置 互 补 的 寡 核 苷 酸 。(1) 择 合 适 的 靶 序 列 ： 设 计 引 物 之 前 ， 必 须 分 析 待 测 靶 序 列 的 性 质 ， 选 择 高 度

32、保 守 、碱 基 分 布 均 匀 的 区 域 进 行 引 物 设 计 。(2) 长 度 ： 一 般 来 说 ， 寡 核 苷 酸 引 物 长 度 为 15 30bp。 (3) Tm 值 ： 引 物 的 Tm 值 一 般 控 制 在 55 60 ， 尽 可 能 保 证 上 下 游 引 物 的 Tm 值 一 致 ，一 般 不 超 过 2 。 若 引 物 中 的 G+C 含 量 相 对 偏 低 ， 则 可 以 使 引 物 长 度 稍 长 ， 而 保 证一 定 的 退 火 温 度 。 (4) G+C含 量 ： 有 效 引 物 中 （ G+C） 的 比 例 一 般 为 40 60 。 (5) 碱 基 的

33、随 机 分 布 ： 引 物 中 四 种 碱 基 的 分 布 最 好 是 随 机 的 ， 不 存 在 聚 嘌 呤 和 聚 嘧 啶 ，尤 其 在 引 物 的 3端 不 应 超 过 3 个 连 续 的 G 或 C。 (6) 引 物 自 身 ： 引 物 自 身 不 存 在 连 续 4 个 碱 基 以 上 的 互 补 序 列 ， 如 回 文 结 构 ， 发 夹 结构 等 ， 否 则 会 影 响 到 引 物 与 模 板 之 间 的 复 性 结 合 ， 尤 其 避 免 3末 端 的 互 补 。 引 物 设 计 的 基 本 过 程 (1) 获 得 目 标 序 列 可 从 实 验 获 取 或 者 核 酸 数 据

34、 库 查 询 得 到 。(2)同 源 性 比 较A、 在 线 的 两 两 比 较 ， 如 www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi 。B、 采 用 软 件 进 行 两 两 或 多 序 列 比 较 ， 如 OMIGA, PCGENE。(3) 引 物 设 计 软 件 进 行 设 计 与 筛 选 如 Primer Premier 5.0 软 件 限 制 性 酶 切 位 点 分 析 软 件酶 切 位 点 （ Restriction Enzyme cutting site） ： DNA上 一 段 碱 基 的 特 定 序 列 ， 限 制性 内 切 酶 能 够 识 别 出 这 个 序 列 并 在 此 将 DNA酶 切 成 两 段 。 限 制 性 内 切 酶 图 谱 ： 是 指 DNA链 上 某 些 限 制 性 内 切 酶 酶 切 位 点 的 分 布 情 况 。分 析 方 法 ：(1) 在 线 分 析 如 ， NEBcutter程 序 （ http:/ WEBcutter程 序 （ http:/ 利 用 常 规 生 物 软 件 的 酶 切 位 点 分 析 功 能 进 行 分 析 如 ， DNAssist2.2、 DNAMAN、 DNAclub