SNP技术及发展和应用.ppt

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1、SNP技 术 及 发 展 和 应 用 SNP的 概 念l 单 核 苷 酸 多 态 性 (single nucleotide polymorphism， SNP),主 要 是 指 在 基 因 组 水 平上 由 单 个 核 苷 酸 的 变 异 所 引 起 的 DNA序 列 多 态性 。 它 是 人 类 可 遗 传 的 变 异 中 最 常 见 的 一 种 。占 所 有 已 知 多 态 性 的 90%以 上 。 SNP在 人 类 基因 组 中 广 泛 存 在 ， 平 均 每 500 1000个 碱 基 对中 就 有 1个 ， 估 计 其 总 数 可 达 300万 个 甚 至 更多 。 SNPs几 种

2、检 测 方 法一 、 区 分 SNPs 位 点 的 方法 1.基 于 杂 交 的 方 法 2.基 于 酶 的 方 法 3.以 构 象 为 基 础 的 方 法 4.直 接 测 序 的 方 法 二 、 检 测 分 析 技 术 1.凝 胶 分 析 技 术 2.荧 光 检 测 技 术 3. DNA 芯 片 4.质 谱 检 测 技 术 SNP检 测 方 法 1.理 想 的 检 测 SNP的 方 法 发 现 未 知 的 SNP， 或 检 测 已 知 的 SNP (1) 灵 敏 度 和 准 确 度 的 要 求 （ 反 应 原 理 严 紧 ） (2) 快 速 、 简 便 、 高 通 量 (操 作 和 分 析

3、的 自 动 化 程 度 高 ） (3) 费 用 相 对 低 廉 1.基 于 杂 交 的 方 法l 原 理 : 短 的 核 苷 酸 探 针 在 和 互 补 的 目 的 片 段 进 行杂 交 时 ， 完 全 匹 配 和 有 错 配 两 种 情 况 下 ， 根 据杂 交 复 合 体 稳 定 性 的 不 同 而 将 SNP 位 点 检 测出 来 。 （ 差 异 越 大 ， 检 测 的 特 异 性 就 越 好 ） 2.基 于 酶 的 方 法1） DNA聚 合 酶2） 连 接 酶3） 限 制 性 内 切 酶4） 外 切 酶 FEN5） RNaseH 1） DNA聚 合 酶l 等 位 基 因 特 异 性 P

4、CRl 多 重 等 位 基 因 特 异 性 PCRl Taqman法l 引 物 延 伸 法l 焦 磷 酸 测 序 法 等 位 基 因 特 异 性 PCR Taqman 法 焦 磷 酸 测 序 法(Pyrosequencinq )l DNA 聚 合 酶 、 ATP 硫 酸 化 酶 (ATP sulfurylase) 、 荧 光素 酶 (luciferase) 和 三 磷 酸 腺 苷 双 磷 酸 酶 ( apyrase) 。l 原 理 ： DNA 聚 合 酶 在 一 种 dNTP的 存 在 下 进 行 引物 延 伸 反 应 ,而 引 物 的 成 功 延 伸 将 伴 随 焦 磷 酸 的 释放 ,焦

5、磷 酸 在 荧 光 素 酶 的 存 在 下 能 引 发 一 种 化 学 发光 反 应 ,通 过 发 光 计 的 实 时 监 测 来 达 到 检 测 的 目 的 。 基 本 步 骤1.测 序 引 物 和 DNA模 板 杂 交 （ PCR扩 增 的 、 单 链 的 ） ， 与酶 和 底 物 孵 育 。2.四 种 dNTP（ dATPS， dTTP， dCTP， dGTP） 之 一 被 加 入 反应 体 系 ， 如 与 模 板 配 对 ， 与 引 物 的 末 端 形 成 共 价 键 ，dNTP的 焦 磷 酸 基 团 （ PPi） 释 放 出 来 。3.一 系 列 的 酶 学 反 应 ， 发 出 可

6、见 光 信 号 。 每 个 光 信 号 的峰 高 与 反 应 中 掺 入 的 核 苷 酸 数 目 成 正 比 。4. ATP和 未 掺 入 的 dNTP由 三 磷 酸 腺 苷 双 磷 酸 酶 降 解 ， 淬灭 光 信 号 ， 并 再 生 反 应 体 系 。5.然 后 加 入 下 一 种 dNTP。 基 于 HRM技 术 的 SNP、 突 变 和 甲 基 化 检 测 l 高 通 量 、 低 成 本 SNP、 突 变 或 甲 基 化 检 测 方 法l 高 分 辨 溶 解 曲 线 分 析 技 术 ： 基 于 高 效 稳 健 的PCR技 术 ， HRM不 受 突 变 碱 基 位 点 与 类 型 局限

7、， 无 需 序 列 特 异 性 探 针 ， 在 PCR结 束 后 直 接运 行 高 分 辨 熔 解 ， 即 可 完 成 对 样 品 突 变 、 单 核苷 酸 多 态 性 -SNP、 甲 基 化 、 HLA配 型 等 的 分析 。 l HRM的 主 要 原 理 是 根 据 DNA序 列 的 长 度 ， GC含 量 以 及 碱 基 互 补 性 差 异 ， 应 用 高 分 辨 率 的 熔解 曲 线 对 样 品 进 行 分 析 ， 极 高 的 温 度 均 一 性 和温 度 分 辨 率 使 分 辨 精 度 达 到 对 单 个 碱 基 差 异 的区 分 l 序 列 比 对 -引 物 设 计 - DNA提

8、取 -荧 光 染 料（ EvaGreen 或 LC green） PCR -结 果 分 析 。 DNA芯 片l DNA芯 片 (DNA chip)技 术 是 近 年 来 新 开 发 的 一种 DNA序 列 变 异 检 测 工 具 。 其 主 要 原 理 是 在 一块 小 硅 片 上 进 行 微 阵 列 分 析 ， 让 目 标 DNA与 密集 的 多 重 寡 核 苷 酸 阵 列 进 行 杂 交 ， 进 而 检 出SNP的 有 效 方 法 。 l Affymetrix生 产 出 人 类 SPlP图 谱 分 析 芯 片 ， 商 品 名 为GeneChipe HuSNP Probe Array。 Hu

9、SNP芯 片 上 集 成 了人 类 基 因 组 22条 人 类 常 染 色 体 及 x染 色 体 上 近 1500个 单核 苷 酸 多 态 性 探 针 。 使 用 时 ， 用 配 套 试 剂 盒 中 的 引 物进 行 多 重 PCR制 备 荧 光 标 记 的 靶 序 列 ， 一 次 杂 交 ， 即 可得 到 样 品 的 近 1500个 SNP信 息 。 这 种 方 法 的 分 析 速 度 比最 好 的 自 动 化 96道 毛 细 管 电 泳 快 3倍 以 上 ， 结 果 重 复 性好 ， 难 确 率 达 98 ， 与 用 传 统 方 法 进 行 同 样 工 作 相 比 ，可 以 大 量 节 约

10、 所 需 的 试 剂 、 样 品 ， 大 大 提 高 劳 动 效 率 。芯 片 上 的 SNP位 点 由 Whitehead研 究 所 MIT基 因 组 研 究 中心 提 供 配 套 分 析 软 件 。 Affymetrlx还 为 初 始 用 户 提 供技 术 培 训 与 支 持 。 SNP在 畜 牧 中 的 应 用l 分 析 病 毒 、 细 菌 基 因 的 多 态 性 ， 有 助 于 人 们 了解 病 毒 、 细 菌 的 感 染 发 病 机 制 与 耐 药 性 机 制 。l 对 于 耐 药 基 因 的 检 测 可 从 两 个 方 面 实 现 ： 一 是通 过 基 因 表 达 诺 芯 片 检

11、测 药 物 诱 导 基 因 表 达 的改 变 来 分 析 其 耐 药 性 ； 二 是 寡 核 苷 酸 芯 片 检 测基 因 组 序 列 的 SNP位 点 来 分 析 耐 药 性 。 目 前 已经 生 产 出 乙 肝 耐 药 、 结 核 杆 菌 耐 药 以 及 艾 滋 病耐 药 的 SNP检 测 基 因 芯 片 ， 用 于 指 导 临 床 对 病人 实 施 个 体 化 治 疗 。 SNP在 牛 QTL定 位 上 的 应 用l 出 生 体 重 、 断 奶 前 日 增 重 和 饲 养 期 日 增 重 是 对 肉 牛 生产 有 重 要 影 响 的 生 长 性 状 ， 这 些 基 因 QTL定 位 将

12、提 高育 种 进 程 ， 在 育 种 过 程 中 应 给 予 考 虑 。 U等 (2002a， b)将 出 生 重 、 断 奶 前 日 增 重 及 饲 养 期 日 增 重 的 QTL已 经精 确 定 位 于 牛 5号 染 色 体 上 。 Li等 (2004)研 究 表 明 ，my 5基 因 的 SNP与 生 长 性 状 之 间 显 著 相 关 。 W Ge等 (2000)根 据 牛 生 长 激 素 受 体 基 因 cDNA序 列 和 人 类 的生 长 激 素 受 体 基 因 序 列 设 计 特 异 性 引 物 ， 利 用 PCRRFLP技 术 ， 检 测 到 了 牛 生 长 激 素 受 体 基 因 上 的 4个SNP， 它 们 分 别 为 TC(位 于 76bp)、 GA(位 于22bp)、 TC(位 于 229bp)和 AG(位 于 257bp)。