一种培养松材线虫的快速简易方法

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1、一种培养松材线虫的快速简易方法作者：刘慧敏，赵爽来源：现代园艺上半月综合版2015年第3期刘慧敏1，赵爽2(1北京市南大荒苗圃，北京100043；2北京市黄垡苗圃，北京102601)摘要：松材线虫病是松树的一种毁灭性病害，致死率高，传播快，治理难度大。松材线虫 病的病原为松材线虫。传统的松材线虫培养方法一般用真菌，如灰葡萄孢、盘多毛孢等，还有 人用高压灭菌的玉米粒接种真菌后培养松材线虫。但是食料真菌培养法其操作过程较为繁杂易 污染，且难以排除食料真菌或消毒剂对实验的影响。本文首次用高压灭菌的马尾松木块培养松 材线虫，快速简单，并且获得的松材线虫保存和使用方便，为进一步研究松材线虫病的机理和 防

2、治方法提供了便利。关键词：松材线虫；培养；灭菌木块松材线虫病又称松树萎蔫病，是松树上最严重的病害，对松树的危害是毁灭性的，因此它 也是我国重要的检疫对象之一1-6。松材线虫病致病力强，寄主死亡速度快；传播迅速，常常 猝不及防；一旦发生，治理难度大。它不仅给国民经济造成巨大损失，也破坏了自然景观及生 态环境，对中国丰富的松林资源构成严重威胁。松材线虫病的病原为松材线虫。有关松材线虫 病的研究一般首先从松材线虫的分离和培养开始。有关松材线虫的培养，国内外都有报道。 Mamiya等首次用灰葡萄抱(Bo try tis cinerea )菌丝体繁殖松材线虫7。我国普遍采用的是 灰葡萄抱和盘多毛抱菌(P

3、estalotia sp. ) 1, 2培养松材线虫。曾永三等报道用长喙壳菌(Ceratocystis sp.)、毛壳菌(Chaelomium sp.)和镰刀菌(Fusarium sp.)培养松材线虫 效果更佳8。另外，贲爱玲等使用玉米粒接种灰葡萄抱来培养松材线虫取得良好效果9。但 是食料真菌培养法其操作过程较为繁杂易污染，且难以排除食料真菌或消毒剂对实验的影响10。本研究首次用高压灭菌的马尾松木块培养松材线虫，并取得良好效果，探寻出了一种更 简单易行的松材线虫培养方法，为进一步研究松材线虫病的机理和防治方法提供了便利。1 材料与方法1.1试验材料1.1.1 马尾松健康木。来源于浙江杭州1.1

4、.2 松材线虫。松材线虫由漏斗法分离，自浙江舟山的感病马尾松中获得。1. 2研究方法1.2.1马尾松健康木的处理。选取马尾松健康木，将其切割成2.5cmX2.5cmX5cm的长方 体小块，每个木块上钻一小孔以便接入线虫液11。将木块置于可高压灭菌的玻璃杯(或者组 培用的培养瓶)中，高压灭菌30分钟。1.2.2 线虫液的处理。将松材线虫液进行表面消毒1。本试验中线虫液的浓度为：4000 头/0.5ml。线虫种群情况为：0.5ml线虫液中，2龄、3龄、4龄、雌虫和雄虫分别为480条、 950条、1640条、830条和100条，其中幼虫3070条，成虫930条，幼虫所占的比例为76.75% 性别比为

5、8.3：1。1.2.3接种线虫。将线虫液摇匀，在超净台上，用消毒好的吸管或者灭菌的加样枪吸取线 虫液0.5ml接种到灭菌木块的小孔里。把培养瓶放入25C的培养箱中繁殖线虫8。1.2.4松材线虫的分离。接种松材线虫22天以后，每天取出4瓶（4个重复），连续取 样8天。取样后，将木块劈成3mm左右的木片，贝尔曼漏斗法分离木块中的松材线虫，同时也 分离瓶壁和封口膜上的松材线虫。2结果与分析接种线虫22天以后，每天取样4瓶，将木块、瓶壁和封口膜上分离到的线虫液混合，稀释 到合适的浓度，在显微镜下计算虫量和繁殖倍数，连续计数8天。松材线虫计数结果和繁殖倍 数如表1和图1所示。结果表明，用灭菌马尾松木块是

6、可以培养松材线虫的。取样第1天，松 材线虫数量最多，最大繁殖倍数为32.9倍；取样最后一天，松材线虫数量最少，最小繁殖倍数 为10.7倍。在取样的8天里，松材线虫数量呈下降趋势。0 5 04?3 2 2 1 kJT .图1匚卩川决:村焼玄鬆肚舛教旳衣乜剽沖:：I不何取样时旬松创ItJl敷目的童山姐律重夏？莹從2垂夏3SS4112657D13SS20WKi12a7702923CO313209G39D92D3037104C673206613073SO)46956068750645806354055B56090520S34605B24O64640045D2055000S253D7呂 96004353

7、043+50416m岂42160373504fi203讨论3.1马尾松木块培养松材线虫简单易行传统的松材线虫培养方法，如用真菌或者玉米粒等食料真菌法培养松材线虫，其操作过程 较为繁杂易污染，且难以排除食料真菌或消毒剂对实验的影响。无异活体培养法其培养周期较 长，产量较低，而且长期培养还可能会改变松材线虫原有的生物学特性10。而用灭菌的马尾 松木块培养松材线虫，操作程序简单，短时间内能获得大量线虫，而且不受真菌食料影响和污 染。另外，目前常用的食料真菌培养法培养松材线虫，需要首先接入真菌，等真菌长满整个平 皿以后才能接入松材线虫，这大约需要1周左右的时间，而用灭菌的木块培养松材线虫不需要 接入真

8、菌，所以能够缩短松材线虫的培养时间。3.2马尾松木块培养的线虫保存方便，活力强从真菌或玉米粒上滤出的线虫液用平皿或者锥形瓶置于冰箱中保存的时间较短，容易造成 线虫生活力降低甚至死亡。而用灭菌的马尾松木块培养的线虫，既可以将已经繁殖好线虫的木 块放入冰箱中长时间保存，也可以将木块中的线虫滤出，将滤出的线虫液直接保存在冰箱中， 保存方法方便。尤其是用线虫液保存松材线虫，在冰箱中放置34个小时后，几乎全部的松材 线虫都沉到容器底部，用吸管吸出，可获得浓度非常大的线虫液，利用起来十分方便。并且据 显微镜观察，这种方法保存的线虫活力很强。原因可能是因为马尾松木块中一些利于松材线虫 生存的水溶性物质溶解到

9、线虫液中，维持着线虫基本的新陈代谢。3.3最佳接种线虫取样时间和接种液体的浓度从图1看，曲线呈下降趋势，随着时间推移逐渐趋于平缓。这说明在取样时间里，松材线 虫的种群数量逐渐减少，最后种群数量维持在一个相对稳定的水平。这表明本试验的取样时间 稍晚，要利用灭菌马尾松木块获得大量松材线虫，建议在接种线虫的1025天内分离线虫。不同浓度的松材线虫接种液，线虫繁殖的速度会有所不同。本实验中松材线虫的接种浓度为4000头/0.5ml，欲获得较大的线虫繁殖倍数，建议将松材线虫的浓度设计在1000头/0.5ml。3.4培养线虫材料的选择、处理探讨因为北方比较干燥，马尾松木块在室内放置一段时间后，水分含量降低

10、很快，建议在高压 灭菌之前，首先将木块在自来水中浸泡 0.51 分钟。未经高压灭菌的马尾松木块培养松材线虫， 培养效果不很理想。因为在接种线虫10余天后，在木块表面上生长出很多真菌，这些真菌大部 分不适宜松材线虫的繁殖。本实验用的材料是马尾松，经过实验，黑松木块也可以用来培养松材线虫。在以往的试验 中，有人用灭菌的松枝条12和松木屑8培养松材线虫，效果很差，但是本文用灭菌木块培养 松材线虫，取得了良好的效果，原因还有待于进一步探讨。用高压灭菌的马尾松木块培养松材 线虫，线虫的营养源肯定不是真菌菌丝体，那是什么，这个问题也需要进一步研究。(收稿：2014-12-12)参考文献：1柴希民，蒋平等松

11、材线虫病的发生与防治M.中国农业出版，2003，1-8，204-2132杨宝君，潘宏阳，汤坚，等.松材线虫病M.北京：中国林业出版社，2003，1-9，147-1493张星耀，骆有庆等中国森林重大生物灾害M.中国林业出版社，2003，1-204赵杰日本的松树萎蔫病及其防治J.植物检疫，1989 (1)： 54-565黄焕华深圳市松树毁灭性疫病-松材线虫萎蔫病J广东林业科技，1990 (6)： 34-356来燕学，翟建中，周成枚，等浙江象山发现松材线虫J.植物检疫，1993, 7 (1)：7 Mamiya Y. The life history of the pine wood nematode

12、 ，Bursnphelettchus lignicolus.Jpn J Nematol，1975(5)：16-258 曾永三，冯志新松材线虫的人工培养J.仲恺农业技术学院学报，1996 (1)： 44-499 贲爱玲，韩正敏，韩旭，等无菌松材线虫的获得及培养方法研究J.南京林业大学学 报：自然科学版，2008，32(3)：99-10210 程剑明，江勇，徐金华松材线虫人工培养研究进展J.安徽林业科技，2009 (3)： 17-1911 刘维志植物病原线虫学M.中国农业出版社，2000，326-33512 Noritoshi Maehara, kazuyoshi Futai.population changes of the pinewood nematode， Bursaphelenchus xylophilus (Nematoda： Aphelenchoididae) ， on fungi growing in pine-branch segment. Appl.Entomol.Zool, 2000， 35 (3)： 413-417第一作者简介：刘慧敏(1980-)，女，硕士，林业工程师，现主要从事公园管理和病虫害 防治工作。