《大学化学教学课件》分子生物学研究法

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1、分子生物学研究法（上） 1、重组 DNA技术发展史上的重大事件 2、 DNA操作技术 3、 RNA的基本操作技术 4、 SNP的理论与应用 5、 基因克隆技术 6、蛋白质组与蛋白质组学与技术 分子生物学从 20世纪中叶开始高速发展，最主 要的 原因之一是基因操作和基因工程技术的进步 。 基因操作： DNA的切割和连接、核酸分子杂交、凝 胶电泳、细胞转化、核酸序列分析、基因的人工合 成、定点突变和 PCR扩增。这是分子生物学研究的 核心技术。 基因工程： 在体外将核酸分子插入载体分子中，使 之进入寄主细胞内并进行持续稳定的繁殖和表达。 跨越天然物种屏障、把来自任何生物的 基因置于毫无亲缘关系的新

2、的寄主生物细胞 之中的能力， 是基因工程技术区别于其他技 术的根本特征。本章将在回顾重组 DNA技术史 上主要事件的基础上，讨论 DNA与 RNA操作技 术、基因克隆技术以及蛋白质组学等几个分 子生物学研究方法的关键环节。 重组 DNA技术史上的重大事件 半个世纪以来，分子生物学研究取得了前所 未有的进步，主要有 3大成就 : 第一，解决了 遗传的物质基础问题 -基因的分子 载体是 DNA; 第二， DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制 机制，解决了 基因的自我复制和世代交替问题 ; 第三， “ 中心法则 ” 和操纵子学说，成功地破译 了遗传密码，阐明了 遗传信息的流动与表达机制。 DNA分

3、子体外切割与连接技术及核苷酸序列分析 技术的进步直接推动了重组 DNA技术的产生和发展。 重组 DNA的核心是用限制性核酸内切酶和 DNA连 接酶对 DNA分子进行体外切割和连接。 这些酶的发 现和应用是现代生物工程技术史上最重要的事件。 限制性核酸内切酶能从特定碱基序列位点切开 DNA。 1972， Boyer实验室发现核酸内切酶 EcoRI能特 异识别 GAATTC序列，将 DNA在这个位点切开产生具 有粘性末端的小片段。 他们还发现， EcoRl酶切产生的任何不同来 源的 DNA片段能通过粘性末端之间碱基互补 作用而彼此 “ 粘合 ” 起来。 此后，大量类似于 EcoRl 但具有独特识别

4、序 列的核酸内切酶被陆续发现。到目前为止， 科学家已经几乎能随心所欲地把任何 DNA分 子切割成一系列不连续的片段，再利用凝胶 电冰技术将这些片段按照分子量大小逐一分 开，以供下一步研究。 DNA操作技术 核酸的凝胶电泳 1.基本原理 生物大分子在一定 pH条件下，通常会带电荷。 将其放置到电场中，就会以一定的速度移向适当 的电极。分子在电场作用下的 迁移速度，与电场 强度和电泳分子所携带的净电荷数成正比，与分 子的摩擦系数成反比。 摩擦系数是分子大小、极 性及介质粘度的函数。根据 分子大小、构型或形 状的差异和带净电荷数，可通过电泳将蛋白质或 核酸分子混合物中的各种成分彼此分离 。 在生理条

5、件下，核酸分子之糖 -磷酸骨架中 的磷酸基团，呈离子化状态， DNA和 RNA多核苷 酸链称为 多聚阴离子 ，把它们放置在电场当中， 会向正电极 的方向迁移。由于糖 -磷酸骨架在结 构上的重复性质，相同数量的双链 DNA几乎具有 等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正 电极方向迁移。在一定的电场强度下， DNA分子 的迁移速度，取决于核酸分子本身的 大小和构 型 。这就是应用凝胶电泳技术分离 DNA片段的基 本原理。 2.琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖是一种线性多糖聚合物。将琼脂 糖粉末加热到熔点后冷却凝固便会形成良好 的电泳介质。 经过化学修饰的 低熔点琼脂糖 ，在较低 的温度下便会熔化，常用于

6、DNA片段的制备 电泳。 琼脂糖凝胶分辨 DNA片段的范围为 0.2 50kb 之间 ;聚丙烯酰胺凝胶分辨范围为 1 1000bp 之 间。凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小 , 浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。例 如， 20%的聚丙烯酰胺凝胶可分离 1-6bp的 DNA小 片段，而若要分离 1000bp的 DNA片段，就要用 3% 的聚丙烯酰胺凝胶。再如， 2%的琼脂糖凝胶可 分离 300bp的双链 DNA分子，而分离大片段 DNA就 要用低浓度 (0.3% 1.0%)的琼脂糖凝胶。 在凝胶电泳中 ， 加入适量溴化乙锭 (ethidium bromide， 简称 EB)染料对核酸分子

7、进行染色 ， 然 后将电泳标本放置在紫外光下观察 ， 检测灵敏快 捷 ， DNA带中含 0.05g 的微量 DNA， 可以清晰地检 测出来 。 EB能插入到 DNA或 RNA分子的相邻碱基之 间 ， 并在 300nm波长的紫外光照射下发出荧光 。 把 EB直接加到凝胶介质中 ， 染料便会与 DNA分子结合 ， 却不能与凝胶相结合 。 这样就只有 DNA分子能吸收 EB并发出荧光 。 在适当的染色条件下 ， 荧光强度 与 D N A 片段的数量成正比 。 载 体 一 载体的概念 ： 1.要把一个有用的基因 （ 目的基因 -研究或应用 基因 ） 通过基因工程手段送到生物细胞 （ 受体细 胞 ） ，

8、 需要运载工具 （ 交通工具 ） 携带外源基因进 入受体细胞 ， 这种运载工具就叫做载体 （ vector） 。 2.凡来源于质粒或噬菌体的 DNA分子 ， 可以插入 或克隆 DNA片段统称为 vector。 3.基因工程所用的 vector实际上是 DNA分子 ， 是 用来携带目的基因片段进入受体细胞的 DNA 二、载体的分类 分类依据 类 别 克隆扩增或表达 举 例 1.按功能分成 （ 1） 克隆载体 （ 2） 表达载体 PBR322 PCDN3 2.按进入受体细胞 类型分 （ 1） 原核载体 （ 2） 真核载体 （ 3） 穿梭载体 PUC8 PBUDCE41 YE 3.按克隆片段得大 小

9、（克隆能力）分 (1)1kb (2)10kb (3)22kb (4)2hr; 95 40min; 97 5min DNA聚合酶 A 变性 95 ， DNA模板变性成为单链，引物自身和引物间局部双 链消除 B 退火， Tm值减 -25 ，使引物与模板 DNA结合互补成双链 C 延伸， DNA聚合酶在 72 催化 DNA的合成 PCR 的基本反应步骤 变性 95 延伸 72 退火 Tm-5 PCR仪 25-30个循环 PCR的基本原理和操作程序 RT-PCR（逆转录 -PCR） 以 mRNA为模板，先进行逆转录得到 cDNA （ complementary DNA， cDNA），再进行的 PCR反

10、应 模板为 mRNA 需逆转录酶 产物为 cDNA RT-PCR与 PCR区别 RT-PCR的基本原理和操作程序 基因的体外突变 DNA和 RNA的微量分析 DNA序列测定 基因突变分析 PCR的其他用途 实时定量荧光 PCR技术于 1996年由美国 Applied Biosystems 公司推出，由于该技术不仅实现了 PCR从定性到 定量的飞跃，而且 与常规 PCR相比，它具有 特异性更强、 有效解决 PCR污染问题、自动化程度高等特点。实时定量 PCR 是指在 PCR指数扩增期间通过连续监测荧光信号强弱 的变化来即时测定特异性产物的量，并据此推断目的基因 的初始量，不需要取出 PCR产物进

11、行分离。目前实时定量 PCR作为一个极有效的实验方法，已被广泛地应用于分子 生物学研究的各个领域。 实时定量 PCR（ real time RT-PCR） 实时荧光定量 PCR 技术的主要应用： 1. DNA 或 RNA 的绝对定量分析：包括病原微生物或病毒含 量的检测 ,转基因动植物转基因拷贝数的检测， RNAi 基因失 活率的检测等。 2. 基因表达差异分析：例如比较经过不同处理样本之间特定 基因的表达差异 (如药物处理、物理处理、化学处理等 )，特 定基因在不同时相的表达差异以及 cDNA 芯片或差显结果的 确证。 3. 基因分型：例如 SNP 检测，甲基化检测等 原理： 根据荧光染料形

12、成特异性荧光信号的强度， 计算出模板 DNA或 mRNA的含量 用途： 定量分析 mRNA或 DNA 优点： 可进行自动化定量分析、降低假阳性 Real time PCR 常用的两种方法分别为 ： Sybr green（荧光染料掺入法） 和 Taqman probe （探针法） SYBR green 在 PCR反应体系中，加入过量 SYBR荧光染料， SYBR荧光染料特异 性地掺入 DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的 SYBR染料分子 不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与 PCR产物的增加 完全同步。 此方法适用： 1、灵敏度高：使用 SYBR可使荧光效果增强到 1000倍以

13、上 2、通用性好 ,不需要设计探针 ,方法简便 ,省时 ,价格低廉。 3、通用型方法，在国内外科研中普遍使用。 4、高通量大规模的定量 PCR检测 5、专一性要求不高的定量 PCR检测。 Taqman Probe PCR扩增时在加入一对引物的同时 加入一个特异性的 荧光探针 ，该探针为一寡核苷酸， 两端分别标记一个报 告荧光基团和一个淬灭荧光基团。 探针完整时，报告基 团发射的荧光信号被淬灭基团吸收； PCR扩增时， Taq酶 的 5-3外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和 淬灭荧光基团分离 ，从而荧光监测系统可接收到荧光信 号，即每扩增一条 DNA链，就有一个荧光分子形成，实现 了荧光

14、信号的累积与 PCR产物形成完全同步。 实时 PCR的基本原理 实时定量 PCR的基本过程 此方法适用： 1、具有高适应性和可靠性，实验结果稳定重复性好，特异 性更高。 2、适用于扩增序列专一的体系的检测。 3、样品中靶基因含量过低的定量 PCR检测。 4、靶基因的特异序列较短，无论怎样优化引物设计条件 都 不能解决。 5、存在与靶基因同源的序列，在 PCR中容易出现非特异性扩 增，对特异性要求较高的定量。 6、广泛用于人类传染病的诊断和病原定量 ,在动物病原体基 因的检测 ,畜禽产品的检验检疫 ,生物制品的鉴定。 实时荧光定量 PCR中的几个术语 1. Ct 值：是指每个反应管内的荧光信号到

15、达设定的域值 时所经历的循环数。（如图所示） 荧光域值（ threshold）： 是指 PCR 反应的前 15 个循 环的荧光信号，荧光域值的缺省设置是 3-15 个循环的荧光 信号的标准偏差的 10 倍，即： threshold。 Ct 值与起始模板的关系： 研究表明，每个模板的 Ct 值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数 越多， Ct 值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标 准曲线，只要获得未知样品的 Ct 值，即可从标准曲线上计 算出该样品的起始拷贝数。 基因组 DNA文库构建 从生物组织细胞提取出全部 DNA，用物理方法（超声波、 搅拌剪力等）或酶法（限制性核酸内切

16、酶的不完全酶解）将 DNA降解成预期大小的片段，然后将这些片段与适当的载体 （常用噬菌体、粘粒或 YAC载体）连接，转入受体细菌或细胞， 这样每一个细胞接受了含有一个 基因组 DNA片段与载体连接的 重组 DNA分子，而且可以繁殖扩增，许多细胞一起组成一个含 有 基因组 各 DNA片段克隆的集合体，就称为 基因组 DNA文库 （ genomic DNA library）。 如果这个文库足够大，能包含该 生物 基因组 DNA全部的序列，就是该生物完整的 基因组 文库， 能从这文库中钓取该生物的全部基因或 DNA序列。从 基因组 含 有生物生存、活动和繁殖的全部遗传信息的概念出发， 基因组 文库是

17、具有生物种属特异性的。 文库构建 提取染色体 DNA DNA片段 插入适当的克隆载体 转入受体菌扩增 基因组文库 基因组文库的构建 机械法或限制 性内切酶切割 基因文库构建示意图 RNA的基本操作技术 总 RNA的提取 RNA提取注意事项： RNA电泳： 28S;18S;5S RNA纯度和浓度的测定 mRNA分离 最普遍的 mRNA分离依赖于与真核生物 mRNA3端 poly(A)互补的含 有 20-30胸腺嘧啶的 oligodT序列。通常将 oligodT链通过 5 的磷酸键与纤维素基质连接，使用者可以通过其来分离纯化 mRNA。 Ambion公司提供了几种 Poly(A)Purist mR

18、NA Purification Kit试剂盒，这 些试剂盒都是基于 oligodT-纤维素原理。 GE（ Amersham Biosciences）公司也提供了几种利用 oligodT-纤维素柱子 的 mRNA纯化试剂盒。 BD生物科学公司和 CLONTECH公司同样也提供了 oligodT- cellulose试剂盒。 CLONTECH公司 QIAGEN公司现利用了乳胶磁珠代替了纤维素与 oligodT共价连 接。乳胶磁珠完美的球形表面能实现均一分布和最小的离心时间，产生纯化 的 mRNA。 cDNA的合成 cDNA第一链的合成 1.寡聚 dT法： poly A tail 2.随机引物法：

19、cDNA第二链的合成方法有以下 2种 : 1、自身引导法 :合成的单链 cDNA 3端能够形成一短的发夹结构， 这就为第二链的合成提供了现成的引物，当第一链合成反应产物 的 DNA:RNA杂交链变性后利用大肠杆菌 DNA聚合酶 Klenow 片段 或反转录酶合成 cDNA第二链，最后用对单链特异性的 S1核酸酶消 化该环，即可进一步克隆。目前很少使用。 2、置换合成法 该方法利用第一链在反转录酶作用下产生的 cDNA:mRNA杂交链不用碱变性，而是在 dNTP存在下，利用 RNA酶 H 在杂交链的 mRNA链上造成切口和缺口。从而产生一系列 RNA引物， 使之成为合成第二链的引物，在大肠杆菌

20、DNA聚合酶 的作用下 合成第二链。该反应有 3个主要优点 : (1) 非常有效； (2) 直接 利用第一链反应产物，无须进一步处理和纯化； (3) 不必使用 S1核酸酶来切割双链 cDNA中的单链发夹环。 细胞总 mRNA 反转录酶 cDNA 插入合适载体 转入受体菌 cDNA文库 cDNA文库的构建 在组织和培养的细胞中，一个细胞 中有些 mRNA可拥有数千个拷贝，而有些 mRNA只有几个拷贝。根据 mRNA分子含量 的多寡，可以将 mRNA划分为高丰度、中 丰度和低丰度 3种不同的类型。 从表中看出低丰度 mRNA，其总量约 占总 mRNA的 30%，约有 11000个左右的不 同种类的

21、 mRNA。如果获得 11000个克隆， 得到每一种低丰度 mRNA的可能只有 30， 因此，为了获得一个能够代表全部低丰 度 mRNA序列的 cDNA基因文库，必须的最 低克隆数 (理论值 )应是 11000/03037000 。 由于在实验中存在着取样差异，有些 序列容易被克隆，有些序列不容易被克隆， 为了保证 cDNA文库中能够包含所有的序列， 必须增加克隆的数目。为了使低丰度 mRNA 的 cDNA克隆达到 99%的期望率，需要筛选 170000个克隆 。 克隆基因的分离 1.应用核酸探针分离克隆目的基因 : 把 cDNA文库转移到尼龙膜或硝酸纤维素 滤膜上，就可以与特异性的核酸探针进 行菌落杂交，以便筛选出具有目的基因 的阳性克隆，这个过程叫作克隆基因的 分离或筛选。 应用核酸探针分离目的基因的方法 叫作核酸杂交筛选法。适用于大规模筛 选。只要有合适的现成可用的核酸探针， 就有可能从生物体的任何组织中分离到 目的基因，也就能够有效地检测任何一 种插入的外源 DNA序列。 分离克隆基因的办法很多，根据不同的 需要再去学习具体的方法，这里就不作一一 介绍了。 p177