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1、营养与食品卫生学营养与食品卫生学首都医科大学首都医科大学 实验二实验二蔬菜中胡罗卜素的测定蔬菜中胡罗卜素的测定(纸层析法纸层析法)营养与食品卫生学学系营养与食品卫生学营养与食品卫生学首都医科大学首都医科大学 一、实验目的一、实验目的通过本次实验掌握用纸层析法分析蔬菜中胡通过本次实验掌握用纸层析法分析蔬菜中胡萝卜素的含量萝卜素的含量。营养与食品卫生学营养与食品卫生学首都医科大学首都医科大学 二、原理二、原理蔬菜的植物色素包括叶绿素、叶黄素及胡蔬菜的植物色素包括叶绿素、叶黄素及胡萝卜素等，它们能被丙酮、石油醚溶液提萝卜素等，它们能被丙酮、石油醚溶液提取出来。将样品提取液进行纸上层析，由取出来。将样
2、品提取液进行纸上层析，由于胡萝卜素极性最小，移动速度最快，从于胡萝卜素极性最小，移动速度最快，从而与其他色素分离；剪下含胡萝卜素的区而与其他色素分离；剪下含胡萝卜素的区带，洗脱后于带，洗脱后于450nm波长下定量测定。波长下定量测定。营养与食品卫生学营养与食品卫生学首都医科大学首都医科大学 三、方法三、方法（一）仪器：（一）仪器：组织捣碎机组织捣碎机层析缸：可用标本缸代替（内径层析缸：可用标本缸代替（内径10cm10cm、高、高25cm25cm）分光光度计分光光度计恒温水浴锅恒温水浴锅点样器或微量注射器点样器或微量注射器新华滤纸：定性，快速或中速，新华滤纸：定性，快速或中速，16cm16cm2
3、0cm20cm 营养与食品卫生学营养与食品卫生学首都医科大学首都医科大学 （二）试剂（二）试剂（1 1）石油醚）石油醚(沸程沸程30306060，分析纯，分析纯)：同时是展：同时是展开剂。开剂。（2 2）丙酮：分析纯。）丙酮：分析纯。（3 3）丙酮石油醚混合液：）丙酮石油醚混合液：37(V/V)37(V/V)。（4 4）无水硫酸钠：分析纯。）无水硫酸钠：分析纯。（5 5）5%5%硫酸钠溶液。硫酸钠溶液。（6 6）胡萝卜素标准溶液：取胡萝卜素标准溶液：取50mg 50mg 胡萝胡萝卜素标准品，溶于数卜素标准品，溶于数mlml氯仿中，然后以石油醚稀氯仿中，然后以石油醚稀释至释至100ml100ml
4、，其浓度约为，其浓度约为500g/ml500g/ml，将此溶液稀，将此溶液稀释释1010倍，即得倍，即得50g/ml50g/ml得胡萝卜素标准应用液。得胡萝卜素标准应用液。营养与食品卫生学营养与食品卫生学首都医科大学首都医科大学 （三）样品的采集和处理（三）样品的采集和处理（1 1）粮食：样品用水洗三次，置）粮食：样品用水洗三次，置6060烤箱烤箱中烤干，磨粉，储于塑料瓶内，放一小包中烤干，磨粉，储于塑料瓶内，放一小包樟脑精，盖紧瓶塞保存，备用。樟脑精，盖紧瓶塞保存，备用。（2 2）蔬菜与其他植物性食物：取可食部用）蔬菜与其他植物性食物：取可食部用水冲洗三次后，用纱布吸去水滴，切碎，水冲洗三次
5、后，用纱布吸去水滴，切碎，用匀浆器制成匀浆，贮于塑料瓶内，冰箱用匀浆器制成匀浆，贮于塑料瓶内，冰箱内保存备用。内保存备用。营养与食品卫生学营养与食品卫生学首都医科大学首都医科大学 四、操作步骤四、操作步骤以下步骤需在避光条件下进行以下步骤需在避光条件下进行（1 1）样品提取：取适量样品，相当于原样）样品提取：取适量样品，相当于原样1 15g(5g(含胡含胡萝卜素约萝卜素约202080g)80g)的匀浆，置的匀浆，置100ml100ml带塞锥形瓶中，加带塞锥形瓶中，加入丙酮入丙酮20ml20ml，石油醚，石油醚5ml5ml，振摇，振摇1min1min，静置，静置5min5min。（2 2）在）在
6、150ml150ml分液漏斗中，放入分液漏斗中，放入5 5硫酸钠溶液硫酸钠溶液30ml30ml。（3 3）将锥形瓶内的提取液小心移入上述分液漏斗中，再）将锥形瓶内的提取液小心移入上述分液漏斗中，再于锥形瓶中加入于锥形瓶中加入10ml10ml丙酮石油醚混合液（丙酮石油醚混合液（3 3：7 7），振摇），振摇1min1min，静置，静置5min5min，将提取液并入分液漏斗中。如此反复提，将提取液并入分液漏斗中。如此反复提取取2 23 3次，直至提取液无色为止。次，直至提取液无色为止。（4 4）振摇分液漏斗，放置分层后，弃去下层水溶液。再）振摇分液漏斗，放置分层后，弃去下层水溶液。再用用5%5%硫
7、酸钠溶液硫酸钠溶液15ml15ml振摇洗涤，反复进行三次，直至下层振摇洗涤，反复进行三次，直至下层水溶液清亮为止，目的是除尽丙酮，防止乳化。水溶液清亮为止，目的是除尽丙酮，防止乳化。营养与食品卫生学营养与食品卫生学首都医科大学首都医科大学 四、操作步骤四、操作步骤（5 5）将石油醚提取液通过盛有）将石油醚提取液通过盛有10g10g无水硫酸钠固无水硫酸钠固体的小漏斗，滤入瓷蒸发皿。用少量石油醚分数体的小漏斗，滤入瓷蒸发皿。用少量石油醚分数次洗净分液漏斗和无水硫酸钠层内的色素，洗涤次洗净分液漏斗和无水硫酸钠层内的色素，洗涤液合并瓷蒸发皿中。液合并瓷蒸发皿中。（6 6）将瓷蒸发皿置于低温电热板上蒸发
8、至约）将瓷蒸发皿置于低温电热板上蒸发至约1ml1ml时，取下，待其自然挥干。冷却后置于冰裕上，时，取下，待其自然挥干。冷却后置于冰裕上，立即用石油醚立即用石油醚2ml2ml沿蒸发皿壁将色素洗下，混匀立沿蒸发皿壁将色素洗下，混匀立即点样。即点样。（7 7）层析）层析点样：准确吸取待检液点样：准确吸取待检液40l40l在滤纸下端基线上在滤纸下端基线上A A、B B两两点之间或点之间或C C、D D两点之间迅速来回进行带状点样一次点两点之间迅速来回进行带状点样一次点完（见图完（见图1 1）。每个样品点）。每个样品点2 2带作为平行样。带作为平行样。营养与食品卫生学营养与食品卫生学首都医科大学首都医科
9、大学 展开：展开：待纸上所点样液自然挥发干后，将滤纸卷成圆筒状，用定待纸上所点样液自然挥发干后，将滤纸卷成圆筒状，用定书机固定两边，置于预先用石油醚饱和的层析缸中（见图书机固定两边，置于预先用石油醚饱和的层析缸中（见图2 2），进行上行展开。（注意纸纹方向与展开方向一致；），进行上行展开。（注意纸纹方向与展开方向一致；缸内石油醚深度约缸内石油醚深度约1cm1cm即可，样斑不能直接接触石油醚。即可，样斑不能直接接触石油醚。营养与食品卫生学营养与食品卫生学首都医科大学首都医科大学 （8 8）洗脱：待胡萝卜素与其他色素完全分开后，取出滤）洗脱：待胡萝卜素与其他色素完全分开后，取出滤纸，自然挥发干石油
10、醚，将位于展开剂前沿的胡萝卜素层纸，自然挥发干石油醚，将位于展开剂前沿的胡萝卜素层析带剪下，立即放入盛有析带剪下，立即放入盛有5ml5ml石油醚的具塞试管中，用力石油醚的具塞试管中，用力振摇，使胡萝卜素完全溶入溶剂中。振摇，使胡萝卜素完全溶入溶剂中。（9 9）比色：用）比色：用1cm1cm比色杯，以石油醚调节零点，于比色杯，以石油醚调节零点，于450nm450nm波长下，测吸光度。波长下，测吸光度。（1010）标准曲线绘制：取浓度为）标准曲线绘制：取浓度为50g/ml50g/ml的的胡萝卜素胡萝卜素应用液应用液2ml2ml放入放入100ml100ml具塞锥形瓶中，以下操作步骤与样品具塞锥形瓶中
11、，以下操作步骤与样品1 19 9项相同，但点样体积分别为项相同，但点样体积分别为20l20l、40l40l、60l60l、80l80l和和100l100l，相当于含胡萝卜素，相当于含胡萝卜素1 1、2 2、3 3、4 4、5g5g。比色后，以胡萝卜素含量为横坐标，以吸光度为纵坐标绘比色后，以胡萝卜素含量为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。制标准曲线。营养与食品卫生学营养与食品卫生学首都医科大学首都医科大学 五、计算五、计算 式中：式中：X2X2样品中胡萝卜素的含量，以样品中胡萝卜素的含量，以胡萝卜素计，胡萝卜素计，mg/100gmg/100g；c c在标准曲线上所查得的胡萝卜素在标准曲线上
12、所查得的胡萝卜素的含量，的含量，gg；V1V1点样体积，点样体积，mlml；V2V2加入瓷蒸发皿内的样品石油醚加入瓷蒸发皿内的样品石油醚提取液浓缩后的定容体积，提取液浓缩后的定容体积，mlml；m m样品质量，样品质量，g g。营养与食品卫生学营养与食品卫生学首都医科大学首都医科大学 六、注意事项六、注意事项样品捣碎时加水不能太多，否则不仅提取困难，样品捣碎时加水不能太多，否则不仅提取困难，还不容易得到均匀样品。还不容易得到均匀样品。滤纸层析一结束，应立即从层析缸中取出，并尽滤纸层析一结束，应立即从层析缸中取出，并尽快剪下胡萝卜层析带进行洗脱，以免氧化使结果快剪下胡萝卜层析带进行洗脱，以免氧化
13、使结果偏低。偏低。本方法适用于植物性食物和含有植物性食物的混本方法适用于植物性食物和含有植物性食物的混合食物中胡萝卜素的测定，其最小检出限为合食物中胡萝卜素的测定，其最小检出限为0.11g0.11g。结果的允许差：同一实验室平行测定或重复测定结果的允许差：同一实验室平行测定或重复测定结果的相对偏差绝对值结果的相对偏差绝对值10%10%。营养与食品卫生学营养与食品卫生学首都医科大学首都医科大学 七、实验报告应包括以下内容七、实验报告应包括以下内容1 1实验目的。实验目的。2 2实验原理。实验原理。3 3实验方法。实验方法。4 4实验操作步骤。实验操作步骤。5 5结果的计算。结果的计算。6 6实验注意事项。实验注意事项。7 7结果的评价和小结。结果的评价和小结。营养与食品卫生学营养与食品卫生学首都医科大学首都医科大学
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