纳米粒溶液粒径

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1、PLGA-PLL-PEG纳米粒的制备药学院浦药剂1005吉冬悦林丽洪峰赵星龙摘要：本课题选用可生物降解材料聚乳酸羟基乙酸(PLGA)、聚赖氨酸(PLL)、聚乙二醇(PEG)作为合成新型 纳米载药系统的原料，通过优化反应条件，制得PLGA-PLL-PEG聚合物。采用该聚合物包载抗白血病经典药物 柔红霉素(DNR)及第三代MDR逆转剂汉防己甲素(Tet)，并偶联转铁蛋白(Tf)，构建一种具有主动靶向性 能的Tf-PEG-PLL-PLGA纳米粒，以期逆转白血病多药耐药。本课题具体研究内容与结果如下：选用复乳化溶 剂挥发法制备共载DNR和Tet的PLGA-PLL-PEG纳米粒，优化工艺条件并交联Tf，

2、其平均粒径为213.012nm, PI值为0.075, zeta电位为-19.16mv，外观规则圆形。纳米粒中DNR载药量为3.630.15%，包封率为70.23 1.91%，Tet 载药量为 4.270.12%，包封率为 86.50.7%，Tf 含量为 2.180.11% (w/w)。 关键字：载药纳米粒子；制备工艺；溶剂扩散法；复乳化溶剂挥发法；转铁蛋白itsIn our research, we use the biodegradable materials including poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA), poly-L-lysine (PL

3、L), polyethylene glycol (PEG) to synthesis novel nanodrug carrier system. We optimize the reaction conditions to synthesis PLGA-PLL-PEG, then use it to delivery the classical antileukemic drug daunorubicin (DNR) and the MDR reversal agents of tetrandrine (Tet) and couple transferrin (Tf).We except t

4、he Tf-PEG-PLL-PLGA nanoparticles can overcome the problem of multidrug resistance of leukemia. The main research contents and results are as follows. We chose double-emulsion method to prepare Tf-DNR/Tet-loaded PLGA-PLL-PEG nanoparticle through optimizing process conditions and cross-linking Tf. Nan

5、oparticle was regular roundness, average size was 213.0 12 nm with polydisperse index (PI) of 0.075, and the zeta potential was -19.16 mv. The drug loading of nanoparticles DNR was 3.63 0.15%, encapsulation efficiency was 70.23 1.91%. The drug loading of Tet was 4.27 0.12%, the encapsulation efficie

6、ncy was 86.5 0.7%, the concentration of transferrin was 2.18 0.11%(w/w).Keywords: drug-loaded nanoparticles; preparation process; solvent diffusion method; double emulsion solvent evaporation method; transferrin1、研究背景药物纳米化可能会使得一些难溶有机化合物用作药物，这将使目前用于医药的合成化学 物质数量增加。用纳米粒子作为药物载体可实现靶向输送、缓释给药的目的，这是因为小粒 子可以

7、进入很多大粒子难以进入的人体器官组织，如小于50n m的粒子就能穿过肝脏内皮或通过淋巴传送到脾和骨髓，也可能到达肿瘤组织。此外纳米粒子还能够越过许多生物屏障到达 病灶部位，如透过血脑屏障把药物送到脑部，通过口服给药可使药物在淋巴结中富集等。而 具有生物活性的大分子药物（如蛋白类，多肽药物等）就很难越过生物屏障，用纳米粒子作 为载体可克服这一困难，并提高其在体内输送过程中的稳定性。并且利用纳米粒子实现基因 非病毒转染，是输送基因药物的有效途径。2、实验材料与方法2.1实验材料试剂厂商聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸-聚乙二醇自制丙酮南京化学试剂有限公司二氯甲烷南京化学试剂有限公司聚乙烯醇1788低粘度型

8、阿拉丁试剂海澡糖国药集团化学试剂叶温80国药集团化学试剂转铁蛋白SigmaBCA试剂盒PiercePharmaciaSepharose CL4B实验仪器厂商Sartorius分析天平R-210旋转蒸发仪WH-2型微型旋涡混合仪85 2型恒温磁力搅拌器德国赛多利斯股份公司瑞士 BUCHI上海沪西分析仪器厂江苏金坛医疗器械厂SCIENTZ-IID超声波细胞粉碎仪宁波新芝生物科技股份有限公司AKTA prime plus蛋白快速层析系统美国GE公司ZetaSizer3000HS型粒径分析仪英国 Malvern 公司KQ-300DB数控超声清洗器昆山市超声仪器有限公司H-7650透射电子显微镜日本日立

9、冷冻离心机GL-20G-H上海安亭科学仪器有限公司冷冻干燥机LGJ-10C北京四环科学仪器有限公司2.2实验方法2.2.1载药纳米粒的制备2.2.1.1溶剂扩散法将模型药物加入PLGA-PLL-PEG的丙酮-二氯甲烷混合液中形成油相，再加入至含乳 化剂的水相中，冰浴，使用匀浆机或者一定频率的超声乳化后，除去有机溶剂。最后使 用冷冻离心机(4C, 15000rpm )离心，去离子水洗两次后，冷冻干燥得纳米粒。2.2.1.2复乳化溶剂挥发法将汉防己甲素及PLGA-PLL-PEG溶于有机溶剂中形成油相，而柔红霉素溶于水相中，将水 相加入油相，使用一定频率超声形成初乳，随即加入至含乳化剂的水相中，采用

10、外力形成复 乳，一定条件下除去有机溶剂。最后使用冷冻离心机(4C, 15000rpm )离心，去离子 水洗两次后，冻干干燥制得纳米粒。2.2.2制备纳米粒工艺的单因素考察内容2.2.2.1溶剂扩散法根据调研，拟考察以下因素对纳米粒载药的影响：聚合物分子量、丙酮/二氯甲烷比例、 载体浓度、超声频率、乳化剂浓度、水相与油相(W/O)比例对载药量的影响。2.2.2.2复乳化溶剂挥发法该制备方法中影响纳米粒粒径及载药的因素主要有：PLGA分子量、载体浓度、内水 相种类、二氯甲烷与丙酮比例、外水相乳化剂浓度、内水相与外水相比例、乳化条件、有机 相除去方式。2.2.3冷冻保护剂的考察为保证纳米粒在冻干后，

11、粒径基本不改变且不会造成漏药，固体结晶均一，体积不变且 不塌陷，故需要考察冻干保护剂的种类。纳米粒的常见保护剂主要有蔗糖、甘露醇、海藻糖、 乳糖，浓度一般选用5%和10%，以粒径、外观及载药量为指标，选择最佳保护剂。2.2.4纳米粒交联转铁蛋白取离心后的纳米粒，使用PBS7.4的磷酸盐缓冲液重悬后，超声30s，与适量的转铁蛋白混 合室温搅拌3h后，加入5%的冻干保护剂，冷冻干燥。2.2.5蛋白含量及蛋白结合效率的测定转铁蛋白浓度使用双辛丁酸(bicinchonic acid，BCA)试剂盒测定。BCA是用于蛋白质分 析的反应试剂。在碱性的条件下，二价铜离子可被蛋白质还原成一价铜离子，一价铜离子

12、和 BCASolutionA(含有BCA)相互作用产生敏感的颜色反应。两分子的BCA螯合一个铜离子，形 成紫色的复合物。该水溶性的复合物在562nm处有较强吸收，故可据其吸光值推算出蛋白浓 度。2.2.5.1 标准曲线的建立按照试剂盒说明书操作，取9个塑料离心管，依次标号为AI号，按下表配置牛血清蛋 白(BSA)标准溶液。表4-1牛血清蛋白标准溶液的制备方法Table 4-1 The preparation method of BSA standard solutionpH 7.4 的 PBS(p L)BSA的体积和来源(p L)BSA的最终浓度A0300p L2000p g mL-1B125

13、375p L1500p g mL-1C325325p L1000p g mL-1D175175p L的B液750p g mL-1E325325p L的C液500p g mL-1F325325p L的E液250p g mL-1G325325p L的F液125p g mL-1H400100p L的G液25p g mL-1I40000p g mL-1取上述BSA标准溶液各0.1mL,与2 mL(A:B=50:1)的工作液混合，密封，孵育，37C保 温30分钟，冷至室温，562nm处测定吸收度(A)，将吸收度(A)对样品浓度(C)进行线性回归， 绘制标准曲线。225.2方法回收率实验按照标准曲线的制备

14、方法制备2507501500AgmL-1三个浓度的BSA溶液,分别取O.lmL, 与2mL(A:B=50:l)的工作液混合，密封，孵育，37C保温30分钟，保温结束后，取出反应管， 冷却到室温，562nm处测定吸收度(A),计算方法回收率。2.2.5.3样品转铁蛋白含量测定取转铁蛋白纳米粒冻干粉适量，溶于去离子水中，高速离心(4C， 15000rpm) 20min, 去离子水清洗，加入定量的蒸馏水重悬，取O.lmL纳米粒溶液，加入至2mL的工作试剂，反 复混合，密封，孵育，37C保温30分钟，取出反应管，冷却到室温，562nm处测试吸收度(A), 据照标准曲线计算蛋白浓度。225.4含量测定方

15、法验证为了验证离心后转铁蛋白是交联在纳米粒上，而非静电吸附，选用凝胶渗透色谱进行检 测，取重悬后转铁蛋白纳米粒溶液、转铁蛋白各0.5mL进样。色谱条件：快速液相色谱系统AKTA FPLC；柱填：Sepharose CL-4B；流动相PBS 7.4磷酸盐缓 冲液；检测波长280nm。2.2.6包封率及载药量的测定2.2.6.1 包封率(entrapment efficiency， EE)为了分离游离柔红霉素及汉防己甲素，本实验选用高速冷冻离心法测定纳米粒的包封率。 在离心力作用下，纳米粒沉淀，去离子水重溶后，冷冻干燥，测定纳米粒中药物的含量。离 心条件:温度为4C,转速为15000rpm/min

16、,离心时间为20min。根据以下公式计算包封率：包封率=W1/W2x100%式中：W为包封的药物的质量(mg), W2为体系中的药物总质量(mg)226.2 载药量(loading content, LC)称取冻干后纳米粒样品W1mg溶于10ml容量瓶中，加入二甲亚砜破坏，按照药物检测方 法检测药物含量W2mg，根据以下公式计算载药量率：载药量=W2/WX100%2.2.7纳米粒粒径及zeta电位测定用三蒸水将纳米粒溶液稀释一定倍数，于Malvren Zetasizer 3000HS激光粒度仪上测定纳 米粒粒径、多分散系数(polydispersity, PI)及zeta电位。2.2.8纳米粒

17、的形态考察滴加适当稀释的纳米粒溶液，磷钨酸负染法染色，滴于点滴反应瓷板的凹槽内，并将喷 碳铜网放于试液上，12 min后取出铜网，用滤纸从铜网边缘吸去残余液体；将该铜网放在染 液滴(2%磷钨酸溶液，pH 7.0)上约30s,吸干多余染液、干燥，日立H-7650透射电子显微镜下 观察纳米粒形态。3.结果与讨论31溶剂扩散法制备纳米粒的单因素考察结果以载药量和粒径为主要考察指标，分别考察聚合物分子量、丙酮/二氯甲烷比例、载体浓 度、超声频率、乳化剂浓度、水相与油相（W/O）比例等六个因素对制剂的影响。从处方各种因素优化结果可见，采用溶剂扩散法装载两种药物的结果并不理想，其对难 溶性药物汉防己甲素的

18、包封较好（8.9%）,而水溶性药物柔红霉素载药量较低（小于2%）,最终 勉强选定的处方：固定投药量柔红霉素和汉防己甲素各为8mg，乳化剂PVA浓度为l%（w/v）, PLGA分子量为30000的共聚物，载体浓度为50mg/mL，水相与油相（W/O）为3:1，丙酮： 二氯甲烷（v/v）2： 1，超声频率幅度85%，所制得的纳米粒溶液在4C存放3d后，发生了沉降 现象，最好的一批纳米粒粒径图如下（332nm左右），故判定此法不适合包封这两种药物。Size Dr=tribut:n 逬 Intens亦iniaiaaS心（d.niiij1Q001DO图4-1纳米粒粒径分布图Figure 4-1 Part

19、ical distribution of Nanoparticles32复乳化溶剂挥发法制备纳米粒的单因素考察结果复乳化法制备纳米粒主要考察制备初乳的条件影响及复乳化条件影响，初乳的影响条件 包含PLGA分子量、载体浓度、内水相种类、二氯甲烷与丙酮比例；复乳化条件影响因素主 要有外水相乳化剂浓度、内水相与外水相比例、乳化条件，有机相去除方式。3.2.1初乳条件的优化PLGA分子量影响本试验主要考察PLGA分子量对纳米制剂质量的影响，固定投药量柔红霉素和汉防己甲 素各为7mg,内水相为6%吐温80,丙酮:二氯甲烷为1:1，载体浓度为50mg/mL，超声频率幅 度95% （3）,乳化剂PVA浓度为

20、1%（w/v）,水相与油相（W/O）为2:1，内水相：外水相为 1:4，选用不同分子量的载体制得的纳米粒载药量及粒径变化如下图所示。粒 径n柔红霉素mlllllll汉防己甲素粒径图4-2 PLGA分子量对纳米粒粒径及载药量的影响Figure 4-2 Effect of PLGA characteristics on the mean diameter anddrug loading of nanoparticles从数据可见，纳米粒的载药量及粒径随载体分子量变大而变大，这可能与纳米粒的粒径 有关，当PLGA载体分子量变大，形成纳米粒内部的空间也变大，相应的载药量及粒径也随之 变大。而载体对汉防

21、己甲素的包封效果比柔红霉素高，可能是由于载体的疏水性区域对难溶 性药物汉防己甲素包封好。考虑到材料的易购性及国内外文献，最终选定采用分子量为30000 的PLGA共聚物作为合成纳米粒的载体。 载体浓度的影响选用分子量为30000的PLGA载体，柔红霉素和汉防己甲素各为7mg，载体浓度在 1050mg/mL时对纳米粒载药量及粒径的影响，固定其他因素不变。载体浓度（mg/mD柔红霉素111川1汉防己甲素直粒径图4-3载体浓度对纳米粒粒径及载药量的影响Figure 4-3 Effect of polymer concentration on the mean diameter anddrug loa

22、ding of nanoparticles图中显示，随着聚合物载体浓度的增大，药物的载药量增大，但纳米粒粒径也随着变大。 这是由于溶剂体系的粘度增大，超声乳化过程中纳米粒的分散性降低，从而引起纳米粒聚集, 粒径分布范围也随之扩大。考虑到载药量及粒径综合结果，最终选用载体浓度为50mg/mL，从 这两个因素筛选中，发现汉防己甲素较柔红霉素载药量高，考虑到柔红霉素为主要考察药物, 故在以后实验中减少汉防己甲素的量。 有机溶剂的影响在溶剂扩散法中发现使用二氯甲烷与丙酮的混合溶剂，能显著减小纳米粒粒径，因此考 察二氯甲烷与丙酮比例范围定为1:11:5,柔红霉素和汉防己甲素各为7mg、5mg柔红霉素汉防

23、己甲素 粒径二氯甲烷：丙酮图4-4丙酮与二氯甲烷比例对纳米粒粒径及载药量的影响Figure 4-4 Effect of acetone/dichloromethane volume ratio on the meandiameter and drug loading of nanoparticles从图中可见，混合溶剂中丙酮的量，对粒径影响较大，随着丙酮增多，粒径变小。可能 由于丙酮加入非溶剂系统形成微滴后，丙酮迅速扩散进入水相，使水相在有机相的界面张力 明显降低；与此同时，界面面积增大，使有机相液滴粒径进一步减小，从而形成粒径较小的 纳米粒。综合载药量及粒径的影响，最后选择丙酮：二氯甲烷为1

24、:1作为有机相。 内水相种类的影响文献中一般制备纳米粒时，对初乳中乳化剂的加入与否很少研究，但考虑到乳化剂对初 乳的稳定性有一定影响，故在此做出研究。分别选用水、0.5%PVA溶液、6%吐温80作为内水 相，从实验结果可知，当选用6%吐温80时，所制得的纳米粒各项指标较好。内水相柔红霉素IIIIIII汉防己甲素直粒径图4-5内水相对纳米粒粒径及载药量的影响Figure 4-5 Effect of internal phase on the mean diameter and drug loading ofnanoparticles3.2.2复乳化溶剂挥发法条件的筛选 乳化条件的影响常见复乳化法

25、有高压均质法及超声法，高压均制法由于有较大死体积不适合少量化，且 有一定浪费，操作没有超声法方便，但其利于工业放大，综合实验结果，制得纳米粒在载药 量及粒径上差别不大，但产率不高，所以本实验选用超声95%的功率。载 药 量543% 210300250粒200径150n100m500柔红霉素IIIIIII汉防己甲素粒径复乳化条件图4-6复乳化条件对纳米粒粒径及载药量的影响Figure 4-6 Effect of emulsification on the mean diameter and drug loadingOf nanoparticles 乳化剂浓度的影响乳化剂在制备复乳中主要使纳米粒稳

26、定，防止纳米粒相互融合、团聚。实验结果发现， 调研发现乳化剂使用聚乙烯醇（PVA）较多，故考察PVA的浓度，结果可见，使用1%的PVA作为乳化剂时，实验结果较好，而继续增加浓度后，制备时粘度过大，不利于超声，且粒径的 多分散性系数（PI）较大。4.54载3.5药3量2.5%21.510.550200150100500PVA浓度250柔红霉素III川I汉防己甲素粒径图4-7 PVA浓度对纳米粒粒径及载药量的影响Figure 4-7 Effect of PVA concentration on the mean diameter and drug loading ofnanoparticles 内

27、水相与外水相的比例固定其他条件不变，考察内水相与外水相的比例，柔红霉素及汉防己甲素的量分别为7mg、 5mg。图4-8内水相与外水相比例对纳米粒粒径及载药量的影响Figure 4-8 Effect of W1/W2 volume ratio on the mean diameter and drug loading of nanoparticles4.54载3.5药3量2.5%21.510.5结果中可以看到，当内水相与外水相的比例为1:8时，粒径较小，且载药量较高，可能 由于外水相过少时超声容易不均，从而纳米粒发生聚集，而过多后水溶性柔红霉素容易溶于外水相中，从而载药量下降。 有机相除去方式调

28、研国内外文献，一般有机相除去方式有旋转蒸发法和室温搅拌挥发，本实验考察这两 种方法对纳米粒质量的影响，其中旋蒸条件为37C, lh；室温搅拌条件为0.3%PVA 60mL,搅 拌3h,其他条件均不变。检测结果发现，旋蒸制得纳米粒粒径显著大于恒温搅拌，故选择恒 温搅拌制备。3.3制备工艺总结将汉防己甲素及载体溶于丙酮与二氯甲烷的混合溶剂(1:1)中，形成油相(0)；柔红霉 素加入的6%吐温80中，形成内水相 代)；将内水相级)滴加入油相(0)中，超声95% (0 3) 2min，形成初乳(W/0)；将初乳迅速滴加至】%咖汎)中，超声95% (0 3) 2min，形成复 乳(W/0/W2),所得溶

29、液滴入0.3%PVA 中,搅拌3h除去有机相，高速冷冻离心(15000rpm, 4C) 20min,所得纳米粒去离子水清洗，使用冻干保护剂溶液重悬，放入-70C冷冻干燥机中预冻、 冻干。空白纳米粒的制备如上法。3.4冻干保护剂的选择纳米粒制成冻干粉后，其稳定性会得到较大改善，但纳米粒在冷冻和解冻过程中，可能 会因内外渗透压的改变，造成微粒裂解，从而粒径变大且发生漏药，因此，需要在冻干过程 中选择合适的冻干保护剂，不同种类的保护剂对纳米粒冻干过程的影响不同，因此需考察不 同种类及浓度的保护剂对纳米粒冻干前后粒径的影响。按照上述处方工艺制备的纳米粒 (224.5nm),分别加入下述保护剂，冻干后检

30、测纳米粒粒径，结果如下：保护剂种类冻干粉外观粒径(nm)蔗糖5%冻干粉表面质脆336.4庶糖10%质脆，晶体感较重354.9甘露醇5%体积不变288.7甘露醇10%体积不变297.1海藻糖5%体积不变，质地细腻235.9海藻糖10%质地细腻242.3乳糖5%容易吸湿253.5乳糖10%容易吸湿269.7从粒径检测结果可见，海藻糖5%及 10%作为冻干保护剂时，冻干粉外观及对纳米粒的保 护均优于其它种类保护剂，但考虑到尽量减少冻干保护剂的量，选择使用5%的海藻糖作为冻干保护剂。3.5蛋白含量的测定3.5.1标准曲线的建立以BSA在562nm处的吸收度(A)对浓度(C)作线性回归分析，得标准曲线方

31、程:y=0.001x+0.062, R2=0.99552.吸收值A,515o.y = O.OOlx i O.O6R2= 0.995001000150020002500蛋白浓度(ug-mL1)图4-9牛血清蛋白的标准曲线Figure 4-9 The standard curve of BSA3.5.2方法回收率表4-2牛血清蛋白的回收率Table 4-2 The recovery of BSA样品浓度测得浓度回收平均回收SDRSD%(p g mL-1)(p g mL-1)率率24196.4025023694.4095.331.011.0623895.2072396.4075071595.3396

32、.441.131.1873297.60143695.731500144196.0795.530.660.69142294.80结果表明：RSD%2%,此方法的回收率良好，方法准确。3.5.3转铁蛋白含量测定图4-10转铁蛋白检测图Figure 4-10 The detection of Tf按照上述测定方法测定三批次转铁蛋白纳米粒(左管显蛋白紫色，右管不显色)，载药 纳米粒平均蛋白含量为2.180.11% (w/w)。3.5.4转铁蛋白含量测定方法验证从图谱可见，转铁蛋白的洗脱时间在52min左右，而离心后的纳米粒溶液在此时间段上 无峰值，只有22min的纳米粒峰，且采用BCA试剂盒检测蛋白后

33、，出现紫色复合物，综合可 见转铁蛋白共价连接到纳米粒上。图4-11转铁蛋白（A）及转铁蛋白纳米粒（B）凝胶渗透色谱图Figure 4-11 Gel permeation chromatography chart of Tf（A）andTf-DNR/Tet-loaded nanoparticles （B）3.6纳米粒载药量和包封率按照最终处方工艺制备3批次的纳米粒，按照测试条件检测包封率及载药量如下:表4-3纳米粒包封率和载药量Table 4-3 Entrapment efficiency and drug loading of nanoparticles批号包封率(%)载药量(%)柔红霉素素汉

34、防己甲柔红霉素素汉防己甲2013031172.486.53.64.22013031369.585.83.54.42013031568.887.23.84.2平均70.2386.53.634.27 土1.910.70.150.123.7纳米粒溶液外观图4-12转铁蛋白修饰的纳米粒Figure 4-12 Tf-DNR/Tet-loaded nanoparticles3.8纳米粒溶液粒径Statistie$-.Giaph (-1 measur已m巳门ts图4-13纳米粒的粒径分布Figure 4-13 Partical distribution of Tf-DNR/Tet-loaded nanopa

35、rticles经激光粒度仪测定所制纳米粒粒径在213.012nm, PI为0.075, zeta电位为-19.16mv,结 果表明纳米粒大小均一。3.9纳米粒微观形态考察透射电镜观察纳米颗粒外观为规则球状，大小均一。图4-14纳米粒电镜图0pmFigure 4-14 Transmission electron photomicrograms of Tf-DNR/Tet-loadednanoparticles4结论在预实验的基础上，最终采用自合成的PLGA-PLL-PEG混合载体，利用复乳化溶剂 挥发法，同时包封柔红霉素及汉防己甲素，采用单因素考察优化制备工艺，并利用载体 PEG末端的CDI基团

36、与转铁蛋白交联，从而提咼靶向性。4.1最佳制备工艺汉防己甲素及载体lOOmg溶于2mL丙酮与二氯甲烷的混合溶剂(1:1) 中,形成油相(O)； 柔红霉素7mg加入0.5mL的6%吐温80中，形成内水相(W1)；将内水相(W)滴加入油相(O) 中，超声95% (3) 2min,形成初乳(W/0)；将初乳迅速滴加至4mL 1%PVA (W2)中， 超声95% (3) 2min，形成复乳(W/0/ W2),所得溶液滴入60mL 0.3%PVA中，搅拌3h除 去有机相，高速冷冻离心(15000rpm, 4C) 20min,所得纳米粒去离子水清洗，使用PBS7.4 的磷酸盐缓冲液重悬后，超声30s,与适

37、量的转铁蛋白混合室温搅拌3h后，加入5%的冻干保 护剂，冷冻干燥。自制的转铁蛋白纳米粒，其平均粒径为213.012nm, PI值为0.075, zeta电 位为-19.16mv,外观规则圆形。纳米粒柔红霉素载药量为3.630.15%,包封率为70.231.91%, 汉防己甲素载药量为4.270.12%，包封率为86.50.7%，转铁蛋白含量为2.180.11% (w/w)。42蛋白含量及蛋白结合效率测定方法本课题采用BCA试剂盒测定蛋白含量，这种分析方法简单快速，重现性好，结果可靠， 同时高速冷冻离心法检测转铁蛋白结合率，操作简便，通过凝胶渗透色谱验证此方法的可行 性，结果表明冷冻离心法能除去

38、游离的转铁蛋白。综上所述，采用复乳化溶剂挥发法和交联法制备的转铁蛋白纳米粒，具有较好的载药量 及蛋白交联率，故本课题在以后的研究中使用的实验药物均采用该方法制备。参考文献1. Brannon-Peppas L, Blanchette JO. Nanoparticle and targeted systems for cancer therapy J. Adv Drug Deliv Rev, 2004, 56(11): 1649T659.2. Kwangjae Cho, Xu Wang, Shuming Nie, et al. Therapeutic Nanoparticles for Drug

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