In-Fusion克隆技术介绍2012new.ppt

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1、In-Fusion克 隆 技 术 介 绍April 19, 2021宝 日 医 生 物 技 术 （ 北 京 ） 有 限 公 司 主 要 内 容 4/19/2021In-Fusion克 隆 技 术 介 绍2 1 In-Fusion技 术 原 理 3 In-Fusion应 用 实 例 4 In-Fusion应 用 文 献 2 In-Fusion实 验 方 法 In-Fusion技 术 原 理 示 意 图 4/19/2021In-Fusion克 隆 技 术 介 绍3 In-Fusion酶 Clontech专 利50 ， 15 min单 管 反 应 In-Fusion技 术 特 点 4/19/2021

2、In-Fusion克 隆 技 术 介 绍4 开 放 性无 缝克 隆多 片 段克 隆In-Fusion 不 受 载 体 限 制不 受 酶 切 位 点 限 制不 附 加 任 何 冗 余 序 列一 次 反 应单 管 操 作 阳 性 率 高达 80% 主 要 内 容 4/19/2021In-Fusion克 隆 技 术 介 绍5 1 In-Fusion技 术 原 理 3 In-Fusion应 用 实 例 4 In-Fusion应 用 文 献 2 In-Fusion实 验 方 法 实 验 方 法 4/19/2021In-Fusion克 隆 技 术 介 绍6 引 物 设 计PCR扩 增片 段 和 载 体 酶

3、切 处 理连 接 体 系 建 立 引 物 设 计PCR扩 增载 体 线 性 化连 接 体 系 建 立传 统 基 因 克 隆 操 作 流 程 In-Fusion基 因 克 隆 操 作 流 程 In-Fusion引 物 设 计 原 则 4/19/2021In-Fusion克 隆 技 术 介 绍7 平 末 端 和 黏 性 末 端 均 可 直 接 进 行 in-fusion连 接引 物 的 5末 端 包 含 与 载 体 末 端 相 同 的 15 bp同 源 碱 基 序 列 ，3末 端 包 含 与 目 的 基 因 片 段 相 同 /相 互 补 的 特 异 碱 基 序 列补 齐 酶 切 位 点 缺 失 碱

4、 基同 源 序 列 部 分 是 与 线 性 化 载 体 末 端 5end前 15 bp相 互 补 的 碱 基 序 列黏 性 末 端 无 需 进 行 末 端 补 平若 保 留 酶 切 位 点 ， 需 补 齐 酶 切 位 点 缺 失 碱 基 In-Fusion引 物 设 计 -原 则 1 4/19/2021In-Fusion克 隆 技 术 介 绍8 黏 性 末 端（ 5 悬 挂 ）黏 性 末 端（ 3悬 挂 ） 平 末 端 In-Fusion引 物 设 计 原 则 4/19/2021In-Fusion克 隆 技 术 介 绍9 平 末 端 和 黏 性 末 端 均 可 直 接 进 行 in-fusio

5、n连 接引 物 的 5末 端 包 含 与 载 体 末 端 相 同 的 15 bp同 源 碱 基 序 列 ，3末 端 包 含 与 目 的 基 因 片 段 相 同 /相 互 补 的 特 异 碱 基 序 列补 齐 酶 切 位 点 缺 失 碱 基同 源 序 列 部 分 是 与 线 性 化 载 体 末 端 5end前 15 bp相 互 补 的 碱 基 序 列黏 性 末 端 无 需 进 行 末 端 补 平若 保 留 酶 切 位 点 ， 需 补 齐 酶 切 位 点 缺 失 碱 基 In-Fusion引 物 设 计 -原 则 2 4/19/2021In-Fusion克 隆 技 术 介 绍10 黏 性 末 端（

6、 5 悬 挂 ）黏 性 末 端（ 3悬 挂 ） 平 末 端 In-Fusion引 物 设 计 原 则 4/19/2021In-Fusion克 隆 技 术 介 绍11 平 末 端 和 黏 性 末 端 均 可 直 接 进 行 in-fusion连 接引 物 的 5末 端 包 含 与 载 体 末 端 相 同 的 15 bp同 源 碱 基 序 列 ，3末 端 包 含 与 目 的 基 因 片 段 相 同 /相 互 补 的 特 异 碱 基 序 列补 齐 酶 切 位 点 缺 失 碱 基同 源 序 列 部 分 是 与 线 性 化 载 体 末 端 5end前 15 bp相 互 补 的 碱 基 序 列黏 性 末

7、端 无 需 进 行 末 端 补 平若 保 留 酶 切 位 点 ， 需 补 齐 酶 切 位 点 缺 失 碱 基 In-Fusion引 物 设 计 -原 则 3 4/19/2021In-Fusion克 隆 技 术 介 绍12 补 齐 酶 切 位 点部 分 缺 失 碱 基 In-Fusion引 物 设 计 在 线 工 具 4/19/2021In-Fusion克 隆 技 术 介 绍13 在 线 工 具 网 址http:/ 片 段 与 载 体 用 量 计 算 工 具PCR引 物 转 换 工 具 载 体 线 性 化 4/19/2021In-Fusion克 隆 技 术 介 绍14 PCR扩 增酶 切 处 理

8、 建 立 In-Fusion连 接 体 系 4/19/2021In-Fusion克 隆 技 术 介 绍15 Rxn Component Cloning Rxn5X In-Fusion HD Enzyme Premix 2 lLinearized Vector x l*Purified PCR Fragment x l*dH2O x lTotal Volume 10 lLinearized vector : Purified PCR fragment(摩 尔 比 )=1:2*10 kb: 50-200 ng*10 kb: 50-200 ng 主 要 内 容 4/19/2021In-Fusion克

9、 隆 技 术 介 绍16 3 In-Fusion应 用 实 例 1 In-Fusion技 术 原 理 4 In-Fusion应 用 文 献 2 In-Fusion实 验 方 法 In-Fusion应 用 4/19/2021In-Fusion克 隆 技 术 介 绍17 应 用多 片 段 克 隆插 入 突 变 位 点 构 建 载 体 模 型高 通 量 克 隆 In-Fusion应 用 实 例 4/19/2021In-Fusion克 隆 技 术 介 绍18 1 多 片 段 连 接 实 验2 定 点 突 变 实 验 In-Fusion TM assembly: seamless engineering

10、 of multidomain fusion proteins, modular vectors, and mutations. Baogong Zhu, Guifang Cai, et al. BioTechniques, Sep 2007; 43:354-359 In-Fusion应 用 实 例 -多 片 段 连 接 4/19/2021In-Fusion克 隆 技 术 介 绍19 多 片 段 连 接 -构 建 真 正 无 缝 融 合 蛋 白 将 白 细 胞 介 素 2 (IL-2)分 泌 信 号 序 列 与 CD101胞 外 域 序 列 （ 删 除 内 源 性信 号 序 列 ） 和 鼠 免

11、 疫 球 蛋 白 G3 (IgG3)的 可 结 晶 片 段 进 行 融 合 ， 构 建 无 缝 融合 蛋 白 IL-2 signal-CD101-Fc ， 并 将 其 转 染 COS细 胞 检 测 表 达 情 况 。实 验 流 程1. 设 计 引 物 ；2. 扩 增 目 的 片 段 及 载 体 线 性 化 ；3.建立In-Fusion连 接 反 应 体 系 。 In-Fusion应 用 实 例 -多 片 段 连 接 4/19/2021In-Fusion克 隆 技 术 介 绍20 引 物 设 计 并 扩 增 目 的 片 段 IL-2 Signal, CD101和 Murine IgG3 IL-2

12、 Signal with Overlaps to NcoI-Digested Vector and CD101, 88-bp PCR ProductSense (NcoI underlined)5-TTCAAATCCACCATGGATAGAATGCAATTGTTG-3Antisense5-CTGTTACTTCTCTCTGAGAATTCGTAACCAAAGCCAAAGACAAAGCAATCA-3CD101, 2799-bp PCR ProductSense5-CAGAGAGAAGTAACAGTTCAGAAA-3Antisense5-GGCCGAGGAGCAGATCCTGGAA-3Murine I

13、gG3 with Overlaps to CD101 and SalI-Digested Vector, 771-bp PCR ProductSense 5-ATCTGCTCCTCGGCCCCTAGAATACCCAAGCCCAGTACC-3Antisense (SalI underlined)5-AGTAACGTTAGTCGACTCAGTGTCTTGTAAGACCCGAGGA-3 In-Fusion应 用 实 例 -多 片 段 连 接 4/19/2021In-Fusion克 隆 技 术 介 绍21 建 立 In-Fusion连 接 反 应 体 系 （ 10 l ）IL-2 Signal CD1

14、01 Domain Murine IgG3 Fc Tail Vector Total Transformants Error-Free/ Sequence (No.) 88 bp, 1.6 ng 2799 bp, 49.3 ng 771 bp, 13.6 ng 11,365 bp, 100 ng 690 1/2结 论 ： 克 隆 阳 性 率 为 50%。 转 染 COS 细 胞 后 ， 融 合 蛋 白 IL-2 signal- CD101-Fc表 达 情 况 良 好 。 In-Fusion应 用 实 例 4/19/2021In-Fusion克 隆 技 术 介 绍22 1 多 片 段 连 接 实

15、 验2 定 点 突 变 实 验 In-Fusion应 用 实 例 -定 点 突 变 4/19/2021In-Fusion克 隆 技 术 介 绍23 定 点 突 变 -完 美 实 现 单 点 多 点 突 变实 验 流 程1. 确 定 突 变 位 点 ；2. 设 计 引 物 ；3. 扩 增 目 的 片 段 及 载 体 线 性 化 ；4. 建 立 In-Fusion连 接 反 应 体 系 。 In-Fusion应 用 实 例 -定 点 突 变 4/19/2021In-Fusion克 隆 技 术 介 绍24 策 略 一 5 Sense Primer (Overlap with Vector Under

16、lined, SpeI Site Bold)5-GCTCGGATCCACTAGTCCAGTGTG-3Antisense Mutant Primer (Mutation Underlined)206-bp PCR Product5-GAAGCGGATGAGTACAGACAGGGCAAAGTC-3Sense Mutant Primer (Mutation Underlined)5-TGTACTCATCCGCTTCTCACAACAGCAACAGC-3 3 Antisense Primer (BspEI Site Bold)509-bp PCR product5-TGTGGCTTCCTCCGGAAGG

17、GTGCTTGGGGTTA-3引 物 设 计 并 扩 增 目 的 片 段 206-bp 和 509-bp 将 human TIM-4 (hTIM-4)第 45位 的 色 氨 酸 （ W或 Trp） 突 变 为 丙 氨酸 （ A或 Ala） ， 构 建 hTIM-4 W45A 突 变 体 。 In-Fusion应 用 实 例 -定 点 突 变 4/19/2021In-Fusion克 隆 技 术 介 绍25 建 立 In-Fusion连 接 反 应 体 系 （ 10 l ）6375-bp fragment containing the vector and 3 end of hTIM-4206-b

18、p PCR Product509-bp PCR product 24 ng 1.6 ng 3.8 ng 结 论 ： 成 功 构 建 了 5个 TIM-4 突 变 体 ， 经 过 测 序 验 证 ， 其 克 隆 阳 性 率 分 别 为 3/3、 3/3、 2/3、 2/3、 1/8。 In-Fusion应 用 实 例 -定 点 突 变 4/19/2021In-Fusion克 隆 技 术 介 绍26 策 略 二 4609-bp PCR ProductSense Mutant Primer (Mutation Underlined)5-AGTTGAGCCCAAATCTTCCGACAAAACTCACA

19、CA-3Antisense Primer5-GATTTGGGCTCAACTTTCTTGTCCACCTTGGTGT-3 将 人 免 疫 球 蛋 白 G1（ IgG1） 第 103位 的 半 胱 氨 酸 （ C或 Cys） 突 变为 丝 氨 酸 （ S或 Ser） ， 构 建 IgG1 C103S突 变 体 。引 物 设 计 并 扩 增 目 的 片 段 4609-bp 结 论 ： 经 过 测 序 验 证 ， 克 隆 阳 性 率 为 33%。In-Fusion连 接 反 应 体 系 （ 10 l ）4609-bp PCR Product 20 ng 主 要 内 容 4/19/2021In-Fusio

20、n克 隆 技 术 介 绍27 4 In-Fusion应 用 文 献 3 In-Fusion应 用 实 例 1 In-Fusion技 术 原 理 2 In-Fusion实 验 方 法 In-Fusion应 用 文 献 4/19/2021In-Fusion克 隆 技 术 介 绍28 1. Comparative Epigenomic Analysis of Murine and Human Adipogenesis Tarjei S. Mikkelsen, Zhao Xu, et al. Cell, Oct 2010 ; 143 : 1561692. In-Fusion BioBrick asse

21、mbly and re-engineeringSean C. Sleight, Bryan A. Bartley, et al. Nucleic Acids Res., May 2010; 38: 2624 - 2636.3. Lumen Thiol Oxidoreductase1, a Disulfide Bond-Forming Catalyst, Is Required for the Assembly of Photosystem II in ArabidopsisMohamed Karamoko, Sara Cline, Kevin Redding, et al. PLANT CEL

22、L, Dec 2011; 23: 4462 - 4475.4. Ehrlichia chaffeensis TRP120 Interacts with a Diverse Array of Eukaryotic Proteins Involved in Transcription, Signaling, and Cytoskeleton OrganizationTian Luo, Jeeba A. Kuriakose, Bing Zhu, et al. Infect. Immun., Nov 2011; 79: 4382 - 4391.5. GMechanism of auxiliary -s

23、ubunit-mediated membrane targeting of L-type (CaV1.2) channels Kun Fang and Henry M. Colecraft. J. Physiol., Sep 2011; 589: 4437 - 4455.6. Crimean-Congo Hemorrhagic Fever Virus-Encoded Ovarian Tumor Protease Activity Is Dispensable for Virus RNA Polymerase Functionric Bergeron, Csar G. Albario, et a

24、l. J. Virol., Jan 2010; 84: 216 - 226.7. CCS5, a Thioredoxin-like Protein Involved in the Assembly of Plastid c-Type CytochromesStphane T. Gabilly, Beth Welty Dreyfuss, et al. J. Biol. Chem., Sep 2010; 285: 29738 - 29749.8. Major taste loss in carnivorous mammalsPeihua Jiang, Jesusa Josue, Xia Li, Dieter Glaser, et al. PNAS, Mar 2012; 10.1073/pnas.1118360109. 技 术 支 持 4/19/2021In-Fusion克 隆 技 术 介 绍29 ：800-810-6261；010-80720985 / 86： ： 我们将竭诚为您服务！ 4/19/2021In-Fusion克 隆 技 术 介 绍30 Thank You ！