第15章核酸的物理化学性质和研究方法.课件

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1、第第1515章章 核酸的物理化学性质和研究方法核酸的物理化学性质和研究方法一、核酸的水解一、核酸的水解 酸、碱、酶水解酸、碱、酶水解作用于磷酸二酯键和糖苷键作用于磷酸二酯键和糖苷键DNA/RNA对酸对酸/碱的碱的耐受程度耐受程度有差别有差别二、核酸的酸碱性二、核酸的酸碱性质质具有芳香环结构特点具有芳香环结构特点能发生酮式能发生酮式/烯醇式、氨式烯醇式、氨式/亚氨式互变亚氨式互变嘌呤和嘧啶碱基都具有弱碱性嘌呤和嘧啶碱基都具有弱碱性 _主要是环内氨基的贡献主要是环内氨基的贡献1 1、碱基的解离、碱基的解离 胞嘧啶中胞嘧啶中 尿嘧啶及胸腺嘧啶中尿嘧啶及胸腺嘧啶中鸟嘌呤和次黄嘌呤中质子鸟嘌呤和次黄嘌呤

2、中质子则结合到则结合到N7上上2、核苷的解离、核苷的解离戊糖可增强碱基的酸性解离戊糖可增强碱基的酸性解离核糖中的羟基也可发生解离核糖中的羟基也可发生解离3.3.核苷酸的解离核苷酸的解离磷酸基使核苷酸具有很强的酸性磷酸基使核苷酸具有很强的酸性DNADNA等电点为等电点为4 44.54.5；RNARNA等电点为等电点为2 22.52.5三、核酸的紫外吸收三、核酸的紫外吸收 碱基含有共轭双键碱基含有共轭双键最大吸收峰最大吸收峰260nm左右左右核酸溶液紫外吸收以核酸溶液紫外吸收以摩尔磷的吸光度摩尔磷的吸光度表示，摩尔表示，摩尔磷即相当于摩尔核苷酸。磷即相当于摩尔核苷酸。：摩尔吸光系数：摩尔吸光系数

3、A：吸收值：吸收值 W：每升溶液磷重量：每升溶液磷重量 L：比色杯内径：比色杯内径OD260的应用：的应用：1.DNA或或RNA的定量的定量OD260=1.0相当于相当于50g/ml双链双链DNA40g/ml单链单链DNA（或（或RNA）20g/ml寡核苷酸寡核苷酸2.判断核酸样品的纯度判断核酸样品的纯度DNA纯品纯品:OD260/OD280=1.8RNA纯品纯品:OD260/OD280=2.0含杂蛋白及苯酚，降低含杂蛋白及苯酚，降低3.判断判断DNA是否变性是否变性四、核酸的变性、复性与杂交四、核酸的变性、复性与杂交(一一)核酸的核酸的变性变性（denaturation）1 1、DNA的变性

4、的变性：在某些理化因素作用下，在某些理化因素作用下，DNA双链解双链解开成两条单链的过程。开成两条单链的过程。某些理化因素破坏了氢键和碱基堆积力，某些理化因素破坏了氢键和碱基堆积力，使核酸分子高级结构改变、理化性质及使核酸分子高级结构改变、理化性质及 生物活性发生改变。生物活性发生改变。不涉及磷酸二酯键断裂，一级结构不变不涉及磷酸二酯键断裂，一级结构不变2 2、变性的实质、变性的实质降解：核苷酸骨架上降解：核苷酸骨架上3，5-磷酸二酯键的断裂磷酸二酯键的断裂DNADNA变性的本质是双链间氢键的断裂变性的本质是双链间氢键的断裂 高温高温（一般（一般7575）热变性热变性 强酸、碱强酸、碱 酸碱变

5、性酸碱变性 甲醛甲醛（Agarose中中RNA）尿素尿素（PAGE中中DNA）3 3、变性因素、变性因素 ODOD260260增高增高 粘度下降粘度下降 比旋度下降比旋度下降 浮力密度升高浮力密度升高 酸碱滴定曲线改变酸碱滴定曲线改变生物活性丧失生物活性丧失4、变性后理化性质变化、变性后理化性质变化RNA变性：从螺旋到线团之间的转变变性：从螺旋到线团之间的转变RNA的变性引起的性质变化没有的变性引起的性质变化没有DNA明显明显完全变性后核酸紫外吸收值增加：完全变性后核酸紫外吸收值增加：天然天然DNA 2540%、RNA 约约1.1%实质：碱基暴露实质：碱基暴露由于变性或降解引起紫外吸收增加的现

6、由于变性或降解引起紫外吸收增加的现象称象称增色效应增色效应DNA变性变性5、DNA热热变性的特征变性的特征变性过程是变性过程是“跃变式跃变式”的，而非渐的，而非渐变变解解链链曲曲线线：连连续续加加热热DNADNA，以以温温度度对对A A260260作图，所得的曲线称为解链曲线作图，所得的曲线称为解链曲线。指增色效应达指增色效应达50%时的温度时的温度一般一般DNA Tm 值在值在85-90 C之间之间 Tm：DNA变变性性时时，OD260达达到到最最大大值值的的50%时时的的温温度度称称为为DNA的的解解链链温温度度或或融融解解温度温度(Tm)。大小与大小与G+C含量成正比。含量成正比。（1

7、1）DNA的均一性：的均一性：（2）GC含量：含量：经验公式：经验公式：XG+C（Tm69.3）2.44（3）介质中的离子强度：介质中的离子强度：Tm值大小与下列因素有关：值大小与下列因素有关：(二二)核酸核酸的的复复性性（renaturation）变性变性DNA在适当的条件下，两条彼此分开的在适当的条件下，两条彼此分开的单链重新缔合成双链单链重新缔合成双链复性复性。热变性的热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，经缓慢冷却后即可复性，这一过程称为这一过程称为退火退火(annealing)。DNA复性复性分子量越大复性越难；分子量越大复性越难；浓度越大，复性越容易；浓度越大，复性越容易；DNA复性

8、也与它本身组成和结构有关复性也与它本身组成和结构有关 （具有很多重复序列（具有很多重复序列DNA，复性快）。复性快）。减色效应减色效应（低色效应）（低色效应）复性时紫外吸收减少的现象复性时紫外吸收减少的现象(三三)核酸的杂交核酸的杂交DNA-DNA杂交双链分子杂交双链分子变性变性 复性复性 不同来源的不同来源的DNA分子分子 SouthernSouthern杂交杂交 NorthernNorthern杂交杂交 WesternWestern杂交杂交Southern杂交是分子生物学的经典实验方法。其基本原理是将待检测的DNA样品固定在固相载体上,与标记的核酸探针进行杂交,在与探针有同源序列的固相DN

9、A的位置上显示出杂交信号。通过Southern杂交可以判断被检测的DNA样品中是否有与探针同源的片段以及该片段的长度。一基因组基因组DNA的限制酶切 二基因组基因组DNA消化产物的琼脂糖凝胶电泳 三DNA从琼脂糖凝胶转移到固相支持物四.探针标记与杂交五.洗膜与检测 http:/ 杂交是用来测量真核生物杂交是用来测量真核生物RNA的量和大小的量和大小估计其丰度的实验方法，可以从大量的估计其丰度的实验方法，可以从大量的RNA样本同时样本同时获得这些信息。其基本步骤包括：获得这些信息。其基本步骤包括：1.完整完整mRNA的分离的分离2.根据根据RNA的大小通过琼脂糖凝胶电泳对的大小通过琼脂糖凝胶电泳

10、对RNA进行进行分离分离3.将将RNA 转移到固相支持物上，在转移的过程中，转移到固相支持物上，在转移的过程中，要保持要保持RNA 在凝胶中的相对分布在凝胶中的相对分布4.将将RNA固定到支持物上固定到支持物上5.固相固相RNA与探针分子杂交与探针分子杂交6.除去非特异结合到固相支持物上的探针分子除去非特异结合到固相支持物上的探针分子7.对特异结合的探针分子的图像进行检测、捕获和分对特异结合的探针分子的图像进行检测、捕获和分析析WesternWestern杂交是将蛋白质电泳、印迹、免疫测定融为一体的特杂交是将蛋白质电泳、印迹、免疫测定融为一体的特异性蛋白质的检测方法。其原理是：生物中含有一定量

11、的目异性蛋白质的检测方法。其原理是：生物中含有一定量的目的蛋白。先从生物细胞中提取总蛋白或目的蛋白，将蛋白质的蛋白。先从生物细胞中提取总蛋白或目的蛋白，将蛋白质样品溶解于含有去污剂和还原剂的溶液中，经样品溶解于含有去污剂和还原剂的溶液中，经SDS-PAGESDS-PAGE电泳电泳将蛋白质按分子量大小分离，再把分离的各蛋白质条带原位将蛋白质按分子量大小分离，再把分离的各蛋白质条带原位转移到固相膜（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，接着将膜浸泡转移到固相膜（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，接着将膜浸泡在高浓度的蛋白质溶液中温育，以封闭其非特异性位点。然在高浓度的蛋白质溶液中温育，以封闭其非特异性位点。然后加入特

12、异抗性体（一抗），膜上的目的蛋白（抗原）与一后加入特异抗性体（一抗），膜上的目的蛋白（抗原）与一抗结合后，再加入能与一抗专一性结合的带标记的二抗（通抗结合后，再加入能与一抗专一性结合的带标记的二抗（通常一抗用兔来源的抗体时，二抗常用羊抗兔免疫球蛋白抗体）常一抗用兔来源的抗体时，二抗常用羊抗兔免疫球蛋白抗体），最后通过二抗上带标记化合物（一般为辣根过氧化物酶或，最后通过二抗上带标记化合物（一般为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶）的特异性反应进行检测。根据检测结果，从而碱性磷酸酶）的特异性反应进行检测。根据检测结果，从而可得知被检生物（植物）细胞内目的蛋白的表达与否、表达可得知被检生物（植物）细胞内目的

13、蛋白的表达与否、表达量及分子量等情况。量及分子量等情况。Western杂交方法灵敏度高，通常可从植物总蛋白中检测出杂交方法灵敏度高，通常可从植物总蛋白中检测出50ng的特异性的目的的特异性的目的蛋白。蛋白。核酸的研究方法核酸的研究方法 制备天然核酸必需采用温和的条件，制备天然核酸必需采用温和的条件，防止过酸、过碱，避免剧烈搅拌，尤其防止过酸、过碱，避免剧烈搅拌，尤其重要的是防止核酸酶的作用重要的是防止核酸酶的作用.一、核酸的分离、提纯和定量测定一、核酸的分离、提纯和定量测定真真核核DNADNA以以核核蛋蛋白白（DNPDNP）形形式式存存在在，DNPDNP溶溶于于水水或或高高盐盐溶溶液液（1mo

14、l/L 1mol/L NaClNaCl），但但不不溶溶于于低低盐盐溶液（溶液（0.14mol/L 0.14mol/L NaClNaCl去除蛋白质：水饱和酚，氯仿异戊醇。去除蛋白质：水饱和酚，氯仿异戊醇。DNADNA沉淀：沉淀：0.3M NaAC-70%0.3M NaAC-70%乙醇乙醇（一）（一）DNA分离纯化分离纯化制备制备RNARNA时，最重要的是使时，最重要的是使RNaseRNase灭活：灭活：所有容器都要经过所有容器都要经过高温处理高温处理，不能高温高压，不能高温高压的用的用0.10.1焦碳酸二乙酯（焦碳酸二乙酯（DEPCDEPC）处理。处理。加入加入强变性剂强变性剂（如胍盐）使（如胍

15、盐）使RNaseRNase失活；失活；在在RNARNA的的反应体系内加入反应体系内加入RNaseRNase的的抑制剂抑制剂（如（如RNasinRNasin)（二）（二）RNA的分离的分离2、定糖法定糖法 RNA：核糖核糖 糠醛糠醛 绿色物质（绿色物质（670-680nm）DNA：脱氧核糖脱氧核糖+二苯胺二苯胺兰色物质（兰色物质（595-620nm）苔黑酚/地衣酚浓HCl浓硫酸1、紫外吸收法紫外吸收法1个个A50g/ml 双链双链DNA 40g/ml RNA或单链或单链DNA（三）核酸含量的测定（三）核酸含量的测定3、定磷法定磷法 核酸含磷量为核酸含磷量为9.5%1g磷相当于磷相当于10.5g核

16、酸核酸4、琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 溴乙锭溴乙锭能插入能插入DNA分子的碱基分子的碱基对对间形成间形成复合物复合物在紫外线照射下溴乙锭发橘红色荧光在紫外线照射下溴乙锭发橘红色荧光 荧光强度与荧光强度与DNA含量成正比含量成正比纯纯DNA DNA 比值比值1.81.8，1.8 Pr1.8 Pr、苯酚污染苯酚污染纯纯RNA RNA 比值比值2.02.0，2.0 DNA 2.0 DNA、PrPr、苯酚污染苯酚污染（四）、核酸纯度的测定OD260OD280二、核酸的沉降特性与超速离心二、核酸的沉降特性与超速离心 不同构象的核酸（线形、不同构象的核酸（线形、环形、超螺旋），密度和沉降环形、超螺旋），

17、密度和沉降速率不同，用密度梯度离心可速率不同，用密度梯度离心可以将不同构象以将不同构象DNADNA、RNARNA与蛋白与蛋白质区分开来质区分开来8M CsCl，45000rpm，16h密度梯度：密度梯度：1.80g/ml1.55g/ml平衡时：浮力密度平衡时：浮力密度=CsCl密度密度=离心力离心力=0+4.22（r2-r02）10-10：浮力密度浮力密度：角速度（弧度角速度（弧度/秒）秒）r：样品到转轴的距离样品到转轴的距离（一）核酸密度的测定G-C含量与含量与DNA的浮力密度之间呈正比关系的浮力密度之间呈正比关系=0.1 xG-C+1.658xG-C=（-1.658）10 （二）测定（二）

18、测定DNADNA的的G-CG-C含量含量RNADNA变性变性DNA双链双链DNA 蛋白质，蛋白质，变性程度越大，浮力密度越大变性程度越大，浮力密度越大（三）研究核酸的构象（三）研究核酸的构象（四）用于核酸的制备四）用于核酸的制备超螺旋超螺旋DNADNA或或用于大片段用于大片段DNA的分离，精度低，但的分离，精度低，但分离范围广。分离范围广。三、核酸的凝胶电泳三、核酸的凝胶电泳（一）琼脂糖凝胶电泳（一）琼脂糖凝胶电泳用于小片段用于小片段DNA的分析的分析相对分子质量小于相对分子质量小于1000bp1000bp的的DNADNA片断片断和和RNARNA的的电泳。电泳。PAGEPAGE中一般不含中一般

19、不含RNaseRNase，用于用于RNARNA分分析时不会分解样品。析时不会分解样品。（二）聚丙烯酰胺凝胶电泳（二）聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGEPAGE）（一）（一）DNADNA的酶法测定的酶法测定四、核酸的核苷酸序列测定四、核酸的核苷酸序列测定英国英国 SangerSanger1955 1955 确定牛胰岛素结构，确定牛胰岛素结构，1958 1958 获诺贝尔化学奖获诺贝尔化学奖1975 1975 设计出设计出DNADNA测序法，测序法，1980 1980 获诺贝尔化学奖获诺贝尔化学奖合成一段与待测合成一段与待测DNADNA序列互补的序列互补的DNADNA片段群。片段群。末端终止法末端终止法

20、Sanger2 2，3 3双脱氧核苷三磷酸双脱氧核苷三磷酸（ddNTPddNTP）是是DNADNA合成链延伸的合成链延伸的抑制抑制剂剂。MOV:MCB4.0Dideoxy sequencing of DNADNA序列分析仪：序列分析仪：四色荧光基团标记的dNTP（二）二）DNADNA的化学法测序：的化学法测序：由由MaxamMaxam和和GilbertGilbert所发明。所发明。其基本原理是用特异的其基本原理是用特异的化学试剂化学试剂作用于作用于DNADNA分子中的不同碱基，然后用分子中的不同碱基，然后用哌啶哌啶切断反应碱基切断反应碱基的多核苷酸链。用的多核苷酸链。用4 4组不同的特异反应，

21、可使末组不同的特异反应，可使末端标记的端标记的DNADNA分子切成不同长度的片断，其末端分子切成不同长度的片断，其末端都是该特异的碱基。经变性胶电泳和放射自显都是该特异的碱基。经变性胶电泳和放射自显影得到测序图谱影得到测序图谱 4 4组特异的反应如下：组特异的反应如下：（1 1）G G反应：反应：用硫酸二甲酯用硫酸二甲酯DMSDMS使鸟嘌呤上的使鸟嘌呤上的N N7 7原子甲原子甲基化，加热引起鸟嘌呤脱落，多核苷酸链可在此处断基化，加热引起鸟嘌呤脱落，多核苷酸链可在此处断裂裂（2 2）G+AG+A反应：反应：用甲酸使用甲酸使A A和和G G嘌呤环上的嘌呤环上的N N原子质子化，原子质子化，从而使

22、其糖苷键变得不稳定，再用哌啶使键断裂从而使其糖苷键变得不稳定，再用哌啶使键断裂（3 3）T+CT+C反应：反应：用肼使用肼使T T和和C C的的嘧啶环断裂，再用哌啶嘧啶环断裂，再用哌啶除去碱基除去碱基（4 4）C C反应：反应：当有盐存在时，只有当有盐存在时，只有C C与肼反应，并被哌与肼反应，并被哌啶除去。嘧啶使修饰碱基脱落，并使去掉碱基的磷酸啶除去。嘧啶使修饰碱基脱落，并使去掉碱基的磷酸二酯键断裂二酯键断裂 32P-GCTACGTA：在A处：32P-GCT和32P-GCTACGT在G处：32p，32p-GCTAC在C处：32P-G和 32P-GCTA在T处：32P-GC和32P-GCTAC

23、G硫酸二甲酯（G）：*ACTTCG*ACTTCGACAG甲酸（G+A）：*A*ACTTCG*ACTTCGA*ACTTCGACA*ACTTCGACAG肼/Nacl（C）：*AC *ACTTC*ACTTCGA C*ACTTCGACAG 肼（C+T）：*AC *ACT *ACT T*ACTTC*ACTTCGAC*ACTTCGACAG从下往上读：CTACGTA，末端G不能读出。32P*ACTTCGACAG（三）三）RNARNA的测序的测序 RNARNA的测序方法有的测序方法有3 3个：个：（1 1）用酶特异切断）用酶特异切断RNARNA链：链：（2 2）用化学试剂裂解）用化学试剂裂解RNARNA（3

24、3）逆转录成）逆转录成cDNAcDNA19951995年年K.MullisK.Mullis发明。基本步骤为：发明。基本步骤为：1.1.设计一对引物以便有效扩增所需要的设计一对引物以便有效扩增所需要的DNADNA序列，并尽量减少可能产生的非特异产物序列，并尽量减少可能产生的非特异产物2.2.优化反应体系：包括适量模板、引物、优化反应体系：包括适量模板、引物、4 4种种dNTPdNTP、TaqTaq DNA DNA聚合酶和适量聚合酶和适量MgMg2+2+http:/ 3个温度进行热循环：个温度进行热循环：变性变性9494，454560s60s；退火，根据引物的退火，根据引物的Tm Tm，1min1

25、min；延伸，延伸，7272，1min1min。循环循环4.4.扩增完成后取出一定量的反应产物，检扩增完成后取出一定量的反应产物，检测扩增结果：先进行凝胶电泳，用溴化乙测扩增结果：先进行凝胶电泳，用溴化乙啶染色，紫外光下检测结果啶染色，紫外光下检测结果y=产物；产物；x=扩增效率；扩增效率；n循环次数循环次数(c)(c)(b)(b)引物引物引物引物2 2553333335555(d)d)新引新引新引新引物物物物5533靶靶靶靶DNADNA的扩增的扩增的扩增的扩增(a)(a)5533引物引物引物引物1 13 3 553355引物引物引物引物2 2互补链互补链互补链互补链引物引物引物引物1 1互补

26、链互补链互补链互补链单位长度的链单位长度的链单位长度的链单位长度的链不同长度的链不同长度的链不同长度的链不同长度的链5 5 3 3 3 3 5 5 引物引物引物引物1 1互补链互补链互补链互补链引物引物引物引物2 2互补链互补链互补链互补链目的片段（不同长度的链未示出）目的片段（不同长度的链未示出）目的片段（不同长度的链未示出）目的片段（不同长度的链未示出）聚合酶链式反应示意图聚合酶链式反应示意图聚合酶链式反应示意图聚合酶链式反应示意图(e)(e)(f)(f)(g)(g)温度温度温度温度（）时间时间时间时间（minmin）9494727260609494变性变性变性变性（1min1min）60

27、 60 退火退火退火退火（1min1min）72 72 延伸延伸延伸延伸（1.5min1.5min）循环循环循环循环1 1 循环循环循环循环2 2 循环循环循环循环3 3PCRPCRPCRPCR反应的温度循环周期反应的温度循环周期反应的温度循环周期反应的温度循环周期如此周而复始，重复进行，直至扩增产物的如此周而复始，重复进行，直至扩增产物的数量满足实验需求为止。数量满足实验需求为止。模板模板DNA（单链）单链）引物引物DNA聚合酶聚合酶（Taq）dNTPMg2+MOV:MCB4.0POLYMERASE CHAIN REACTION六、六、DNA的化学合成的化学合成 图图15-615-6固相合成法（亚磷酸三酯法）合成固相合成法（亚磷酸三酯法）合成DNADNA合成方向：合成方向：3 53 5端端5-OH5-OH用二对甲氧三苯甲基（用二对甲氧三苯甲基（DMTDMT）保护。保护。3-OH3-OH用氨基亚磷酸化合物活化用氨基亚磷酸化合物活化碱基上氨基用苯甲酸保护碱基上氨基用苯甲酸保护