过氧化氢酶及过氧化物酶的作用

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1、生物化学实验指导一、内容简介 生物化学是一门课堂理论与实验技术相结合的专业基础课。实验主要以生物大分子制备 的一般过程以及电泳和层析等生物化学技术为主，采用经典和现代分析技术相结合的实验方 法和手段进行设计，实验内容既包含生物化学研究技术的基本方法，又反映生物化学研究技 术的发展水平。开设实验为30 学时，共有13 个实验可供选择，其中验证性实验4 个，综合设计实验9 个。由三部分所组成：1酶的性质及活力测定等； 2蛋白质的分离、纯化、鉴定及含量测定； 3DNA 的提取、分离及含量测定二、实验教学目标与基本要求 通过本课程学习，使学生掌握常用的生物化学分析与制备技术，理解其基础理论，从而 使学

2、生增强对生物化学理论的感性认识，掌握有关生物科学研究的基本技术，并提高学生的 动手能力。三、实验项目与学时分配序号实验项目学时备注验 证 性 实 验1唾液淀粉酶活性的观察3任选二2琥珀酸脱氢酶的作用及竞争性抑制的观察33转氨酶的活性测定34脂肪酸的B-氧化-酮体测定法3综合 设计 实验I5血清IgG的分离制备-盐析法3任选三6凝胶层析法脱盐和分离蛋白质57DEAE-离子交换剂纯化血清IgG58聚丙烯酰胺凝胶电泳法鉴定IgG纯度59紫外吸收法测定蛋白质含量2综合设计 实验II10动物组织中DNA的制备4任选三11琼脂糖凝胶电泳检测DNA412紫外吸收法测定DNA含量213脂肪含量及其碘值的测定3

3、四、实验内容实验 1 脂肪含量及其碘值的测定（一）、脂肪的定量测定原理脂肪类化合物一般都溶于有机溶剂（如乙醚、石油醚）而不溶于水或微溶于水，利用此 特性，可以用索氏脂肪提取器抽提出样品中的脂肪。索氏脂肪提取器 索氏（Soxhle t）脂肪提取器为一回馏装置,由浸提管，小烧瓶及冷凝管三者联接而成，浸提管两侧分别 有虹吸管及通气管。盛有样品的滤纸包放在浸提管内，溶剂乙醚（或石油醚）盛于小烧瓶中， 加热后，溶剂蒸汽经通气管至冷凝管，冷凝的溶剂滴入浸提管，浸提样品。浸提管内溶剂愈 积愈多，当液面达到一定高度，溶剂及溶于溶剂中脂肪类物质经虹吸管流入小烧瓶。 小烧瓶的溶剂由于受热而汽化，气体至冷凝管而滴入

4、浸提管内，如此反复提取回馏，将样品 中脂肪类物质提尽并带到小烧瓶中。最后将小烧瓶中的溶剂蒸去，烘干，小烧瓶的增重，就 是样品中所含脂肪的量。因本法提取的物质，除中性脂肪外，还会有游离脂肪酸、蜡、磷脂、固醇及色素等脂溶 性物质，固提出的物质只能称粗脂肪。器材与试剂器材：天平，索氏脂肪提取管，恒温水浴锅，滤纸。 试剂：乙醚（ 不含有过氧化物， 乙醇及水分）沸点36C。去过氧化物的处理：将乙醚装入分液漏斗，加入乙醚量1/5的10硫酸亚铁（100克硫 酸亚铁溶于600ml水中，再加30ml浓硫酸酸化，并稀释至1000ml），充分混合后，澄清分 层，放出水液。过氧化物鉴定法：6ml乙醚于试管中，加2ml

5、l0%碘化钾溶液，猛烈混合，放置1分钟， 下层碘化钾呈黄色，即表示有过氧化物存在。去乙醇的处理：加乙醚量1/5的10氢氧化钾溶液洗涤，洗后放出水溶液，重复2-3次。 去水分的处理：在乙醚瓶中加入适量细粒无水氯化钙，放置一昼夜，时加摇荡，将上层清液 移入蒸馏瓶蒸馏。方法与步骤1将洗净的索氏提取器小烧瓶用铅笔在磨口处编号，103-1O5C烘2小时至恒重，冷却后准确 称重，并记录瓶重。2. 用分析天平称取干样（需研碎过40目筛孔）约2克，用滤纸包好，放入浸提管内，纸包长 度不能超过虹吸管高度。3. 于已称重的小烧瓶内倒入1/2-1/3体积的无水乙醚（其量应略大于浸提管内体积），联接 索氏提 取器各部

6、分（不能涂凡士林）。置约70C恒温水浴锅内（水必须是蒸馏水或置于电 热板上）控制加热温度，使每小时回馏35次较宜，一般提取1 0小时左右。4. 提取完毕，待乙醚完全流入小烧瓶时取滤纸包，再回馏一次以洗涤浸提管。继续加热，待 浸提管内乙醚面接近虹吸管上端而末流小烧瓶前，倒出浸提管中的乙醚，如果小烧瓶中尚留 乙醚，则继续加热蒸发，直至小烧瓶中溶剂基本蒸完。停止加热，取下小烧瓶，用吹风机在 通风橱中将瓶中残留乙醚吹尽。再置103 1O5C烘箱中烘半小时，取出冷却后立即称重。5计算：粗脂肪含量（%）=提取瓶的增重（g）/样品重量（g）X100注意事项乙醚为易燃品，切 忌明火加热，同时要注意提取器各联接

7、处有否漏气以及冷凝管效果是否良好，以免大量乙醚 气外逸，使人麻醉。（二）、碘值的测定原 理脂肪中的不饱和脂肪酸碳链上有不饱和键，可以吸收卤素（Cl2、Br2或1丿。不饱 和键数目越多，吸收的卤素量也越多。每10 0克脂肪，在一定条件下，所吸收的碘的克数, 设为该脂肪的碘值，即碘值愈高，不饱和脂肪酸的含量愈高。碘值是检定和鉴别油脂的一个重要常数，可以用来推算油、脂的定量组成。由于碘和脂 肪的加成作用很慢，本实验采用汉诺斯（Hanus ）溶液，它由碘与溴相混合产生IBr, 溴化碘更易与脂肪起加成作用，该溶液中加入冰醋酸，可使溶液更加稳定，反应过程如下：（1）加成作用：RCH -CH=CH-（CH2

8、）n-C00H+IBr- RCH ICH-CHBr-（CH2）n-C00H22（2）剩余溴化碘中碘的释放IBr+KI- I2+KBr用硫代硫酸钠滴定释放出来的碘2NaI+Na2S4O6器材与试剂器材：碘量瓶（250-300ml）,量筒（1 0、50m 1）,滴定管（50m 1）,分析天平 或扭力天平。试剂：（1）汉诺斯（Hanus ）溶液：取12 2克碘，放入1 5 0 0 m1锥形瓶内, 徐徐加入1 0 0 0 m1冰醋酸（9 9.5%），边加边摇，同时略加温热，使碘溶解。冷却 后，加溴约3m1。（2）0 . 1N标准硫代硫酸钠溶液：将结晶硫代硫酸钠50克溶在经煮沸后冷却的蒸馏水中（无C02

9、存在），添加硼砂7 . 6克或氢氧化钠1.6克（硫代硫酸钠溶液在pH9 - 10最稳定）。稀释到2 0 0 0 m1。（3）四氯化碳（4）1%淀粉溶液（溶于饱和氯化钠溶液中）（5）10%碘化钾溶液（6）花生油和猪油方法与步骤1. 称样。称取0.30.4克花生油和0.5克猪油分别放入两只干燥的碘量瓶中，第三 只碘量瓶不加样品作为空白。三只碘量瓶中各加入10m1四氯化碳轻轻摇动，使油全部溶 解。2 .加汉诺斯溶液。每只碘量瓶中各准确加入2 5m1，勿使溶液接触瓶颈。塞好玻璃塞， 在玻璃塞与瓶口之间加数滴10%碘化钾溶液封闭缝隙，以防止碘升华渗出，造成测定误差 在2 0 - 3 0C暗处放置3 0分

10、钟，并不时摇动。3使过剩的IBr出12。放置3 0钟后，小心打开瓶塞，使塞旁碘化钾溶液流入瓶内，切勿丢 失，加入10%碘化钾1 0m1，用50m1蒸馏水冲洗瓶塞与瓶颈。4 用NazSz%滴定释放的I2。用0- 1NNa2S203溶液迅速滴定至瓶内溶液呈浅黄色，加入】 淀粉约1m1,继续滴定，将近终点时，用力振荡，使碘由四氯化碳全部进入水溶液内。再 滴至蓝色消失为止，即达到滴定终点。5 计算碘值：碘值=（A-B）X100/C D式中:A为滴定空白用去的硫代硫酸钠溶液的ml数。B为滴定样品用去的硫代硫酸钠溶液ml数。C为样品重量T为与1ml 0.1N硫代硫酸钠溶液 相当的碘的克数。在本实验中 T=

11、0.1X126.9/1000=0.01269（克/ml）注意事项1. 卤素加成反应是可逆反应，只有在卤素绝对过量时，该反应才能进行完全，所以，油吸收的碘量不应超过汉诺斯溶液所含碘量的一半。若瓶内混合液的颜色很浅，表示油用量过多 应再称取较少量的油，重作。2. 滴定时要用力振荡，如振荡不够，四氯化碳层呈现紫色或红色，此时需继续用力振荡使 碘全部进入水层。实验 2 唾液淀粉酶活性的观察一）原理酶是指化学本质为蛋白质的生物催化剂。在一定条件下，酶促化学反应进行的能力即称为酶活性(酶活力)。影响酶活性的因素是多方面的，如温度、PH及某些化学物质等都会影 响酶的催化活性。在一定条件下，能使酶活性达到最高

12、时的温度即酶的最适温度，而能使酶 活性达到最高时的PH即酶的最适PH。例如，唾液淀粉酶的最适温度是37C，而其最适PH 是 6.8。能增高酶活性的物质称为酶的激活剂，能降低酶活性却又不使酶变性的物质叫酶的抑 制剂。凡能使蛋白质变性的因素都可以使酶变性而丧失活性。酶活性通常是通过测定酶促化学反应的底物或产物量的变化来进行观察的。本实验用唾液淀粉酶为材料来观察酶活性受理化因素影响的情况。唾液中含有唾液淀粉 酶。淀粉在该酶的催化作用下会随着时间的延长而出现不同程度的水解，从而得到各种糊精 乃至麦芽糖、少量葡萄糖等水解产物。而碘液能指示淀粉的水解程度淀粉遇碘可呈紫色 暗褐色与红色，而麦芽糖与葡萄糖遇碘

13、则不呈颜色反应，如图所示：淀粉酶淀粉糊精淀粉酶麦芽糖+少量葡萄糖加碘后： (蓝色)紫红色、暗褐色或红色等)棕黄色，碘本身颜色(二) 试剂及器材：(1) 0.5% (W/V)淀粉溶液：称取0.5g可溶性淀粉，加少量预冷的蒸馏水，在研钵中调 成糊状，再徐徐倒入约90ml沸水，同时不断搅拌，最后加水定容为100ml即成。要求新鲜配 制。(2) 稀碘溶液：称取1.2g I2、2g KI,加少量蒸馏水溶解后，再加蒸馏水至200m 1。保存 于棕色瓶中，用前5 倍稀释。(3) 不同PH溶液：A液一0.2mo1/L Na2HPO4溶液：称取35.62g Na2HPO4 12H2O，将之溶于蒸馏水后定容至 1

14、000ml。B0.1mo1/L柠檬酸溶液：称取19.212g无水柠檬酸，将之溶于蒸馏水后定容至1000ml。 PH5.0缓冲液取A液10.3ml、B液9.7m 1混合而成。 PH6.8缓冲液取A液14.55ml、B液5.45ml混合而成。 PH8.0缓冲液取A液19.45ml、B液0.55ml混合而成。(4) 0.5% (w/v)蔗糖溶液：称取蔗糖0.5g，将之溶于蒸馏水后定容至100ml。( 5)斑氏试剂：A液一称取无水CuSO417.4g，将之溶于100ml预热的蒸馏水中，冷却后用蒸馏水稀释至 150ml。B液一称取柠檬酸钠173g、Na2C03100g，再加蒸馏水600ml,加热溶解后冷

15、却，用蒸馏 水稀释至 850ml。将A液与B液混合即得斑氏试剂。(6) 1% (w/v) NaCl溶液：称取NaCl 1g,将之溶解后用蒸馏水稀释至100ml。(7) 1% (w/v) CuSO4溶液：称取无水CuSO4 1g,将之溶解后用蒸馏水稀释至100ml。(8) 白瓷板(或比色板)、恒温水浴锅、电炉(三) 操作1唾液淀粉酶应用液的制备(1) 每人取一个干净的饮水杯，装上蒸馏水。(2) 先用蒸馏水漱口，将口腔内的食物残渣清除干净。(3) 口含约20ml蒸馏水，做咀嚼动作12min,以分泌较多的唾液。然后将口腔中的唾 液吐入一个干净的小烧杯中注1。(4) 取一块干净的白瓷板，按下表操作：唾

16、液注2（滴）0.5%淀粉溶液（ml）22 2222222222弃去碘液注 3（滴）111111观察结果（颜色），以呈棕红色者浓度为准，稀释原唾液作应用液。2温度对酶活性的影响注4（ 1 ）取 3 支试管，按下表进行实验。试管编号1230.5% 淀粉（ml）555PH6.8缓冲液（ml）0.50.50.5稀释唾液（ ml）0.50.50.5不同温度（C）置冰水浴中置37C水浴中置沸水浴中将各管中的试剂加好后混匀，然后及时在上述温度下分别进行处理。（2）在干净的比色板上，于各孔穴中分别滴加 2 滴碘液。（ 3）每隔 1min 从第 2 支试管中取反应液 1 滴，与比色板孔穴中的碘液混合，观察颜色

17、的变化。（ 4）待第 2 支试管中的反应液与比色板孔穴的碘液混合后颜色不再变化时，取出试管， 并将在沸水浴中处理的试管用冷水冷却，然后向各试管中滴加碘液 13 滴。摇匀后观察并记录各管颜色，比较管中淀粉水解的程度，说明温度对酶活性的影响。 3PH 对酶活性的影响（ 1 ）取 3 支试管，按下表编号进行实验。管号1230.5% 淀粉（ml）222不同PH的缓冲液（ml）PH5.0PH6.8PH8.0222稀释唾液（滴）101010摇匀后，将各管置于37C水浴中处理注5。（2）每隔lmin从PH6.8的试管中取出1滴反应液滴于白瓷板上，随后滴加稀碘液1滴， 观察其颜色变化。（3）待颜色呈棕色时，向

18、各管中加稀释碘液13滴。观察各管颜色，比较各管中淀粉水 解的程度，解释PH对酶活性的影响。4酶反应的特异性（ 1 ）取2支试管，按下表编号后进行实验。试管号0.5% 淀粉(ml)0.5%蔗糖( ml)2稀释唾液(ml)11(2) 摇匀后，将各管置于37C水浴中处理10min。(3) 取出试管，分别加入斑氏试剂2ml，混匀。(4) 将各管置于沸水浴中煮沸25min。观察并解释结果。5激活剂与抑制剂对酶活性的影响(1)取3支试管，按下表编号后进行实验。管号1230.5% 淀粉（ml）333PH6.8缓冲液(ml)0.50.50.51%NaCl 溶液（ ml）11%CuS04 溶液（ml）1蒸馏水(

19、 ml)1稀释唾液(ml)111(2)将各管摇匀后，一起放入37C水浴中保温。(3) 每隔1min从第1支试管中取出1滴反应液滴于白瓷板上，随后滴加稀碘液1滴于 此滴反应液中，观察其颜色变化。(4) 待加碘后颜色呈棕色时，取出3支试管，分别加入稀碘液13滴。观察、比较各管 颜色的深浅，并解释之。注：1 可以根据实际情况，用纱布或滤纸过滤一下收集滤液使用。2 加唾液时，只在第1穴中加入2 滴新制备的唾液。将之与该穴中的蒸馏水混匀后，取出2滴加入第 2 穴中。待混匀后又从第2穴中取出2滴加入第3穴。如此继续操作，直到从第6穴中取出2 滴弃去。待穴中 颜色呈红棕色时，即可照该穴中唾液的稀释度稀释制备

20、的唾液，并用稀释好的唾液进行下面的实验。3 在往白磁板的孔穴内依次加完蒸馏水、稀释好唾液并且加完淀粉溶液之后，加入碘液之前，应放置 5min。4 为确保实验的效果，在加入试剂时宜在冰浴条件下进行，尤其是气温较高的南方地区要注意。5 加唾液时应从第1管开始依次进行，前后管之间大约相隔时间57s。实验 3 琥珀酸脱氢酶的作用及竞争性抑制的观察(一) 原 理琥珀酸脱氢酶是三羧酸循环中的一个重要的酶，测定细胞中有无这种酶可以初步鉴定 三羧酸循环途径是否存在。琥珀酸脱氢酶可使其底物脱氢，产生的氢可通过一系列传递体最 后递给氧而生成水。在缺氧的情况下，若有适当的受氢体也可显示出脱氢酶的作用。如心肌 中的琥

21、珀酸脱氢酶在缺氧的情况下，可使琥珀酸脱氢生成延胡索酸，脱下之氢可将蓝色的甲 烯蓝还原成无色的甲烯白。这样，便可以显示琥珀酸脱氢酶的作用。琥珀酸+甲烯蓝琥珀酸脱氢酶卜延胡索酸+甲烯白无氧条件丙二酸的化学结构与琥珀酸相似，它能与琥珀酸竞争而和琥珀酸脱氢酶结合。若琥珀酸 脱氢酶已与丙二酸结合，则不能再催化琥珀酸脱氢，这种现象称为竞争性抑制。如相对地增 加琥珀酸的浓度，则可减轻丙二酸的抑制作用。（二）试 剂1. 1.5%琥珀酸钠溶液：称取琥珀酸钠1.5g，用蒸馏水溶解并稀释至100m 1。如无琥珀酸 钠可用琥珀酸配成水溶液后，以氢氧化钠溶液中和至pH78。2. 1%丙二酸钠溶液：称取丙二酸钠1g,用蒸

22、馏水溶解并稀释至100ml。3. 0.02%甲烯蓝溶液。4. 1/15mo1/LNa2HPO4溶液：取Na2HPO4 2也0 11.8g，用蒸馏水溶解并稀释至1 000ml。5. 液体石蜡。（三）操 作1.猪心脏制备液：称取新鲜猪心 1.52.0g 放组织捣碎机中，加入等体积的石英砂及1/15mo1/LNa2HPO4溶液 34m 1,捣碎成浆，再加入 67m11/15mo1/LNa2HPO4溶液，放置 1 小 时，不时摇动，离心取上清液备用。2取4支试管，编号并按卜表操作：试管心脏制备液1.5%琥珀酸钠溶液（滴）1%丙二酸钠溶液（滴）蒸馏水（滴）0.02%甲烯蓝溶液（滴）（滴）15510225

23、（先煮沸）510235555245105523. 各管溶液混匀后，每管各加液体石蜡一薄层（约510滴）。为什么？4. 各管置于37C水浴中，半小时内观察各管颜色变化，比较其速度并说明原因。然后将第 1 管用力摇动，观察其有何变化？为什么？实验 4 转氨酶活性的测定（一）原 理转氨酶是体内重要的一类酶。转氨酶催化a -氨基酸的a -氨基与a -酮酸的a -酮基 之间的相互转化，从而生成一种新的氨基酸与一种新的酮酸，这种作用称为转氨基作用。它 在生物体内蛋白质的合成、分解等中间代谢过程中，在糖、脂及蛋白质三大物质代谢的相互 联系、相互制约及相互转变上都起着很重要的作用。在动物机体中活力最强、分布最

24、广的转氨酶有两种：一种为谷氨酸丙酮酸转氨酶（简称GPT），另一种为谷氨酸草酰乙酸转氨酶（简称GOT）。它们的催化反应如下：GPT丙氨酸+ a -酮戊二酸匚卜 谷氨酸+丙酮酸37CGOT天冬氨酸+a -酮戊二酸37C草酰乙酸 + 谷氨酸GOT 催化生成的草酰乙酸在柠檬酸苯胺的作用下转变为丙酮酸与二氧化碳。由上可见此 反应最终产物都是丙酮酸。测定单位时间内丙酮酸的产量即可得知转氨酶的活性。丙酮酸可与2,4 -二硝基苯肼反应，形成丙酮酸二硝基苯腙，在碱性溶液中显棕红色。再与同样处理的丙酮酸标准液进行比色，计算出其含量，以此测定转氨酶的活性。丙酮酸+ 2,4 -二硝基苯月井丙酮酸二硝基苯腙（棕红色）转

25、氨酶的活性单位为：每毫升血清与基质在37C下作用60min,生成1p mol丙酮酸为1 个单位。（二）试 剂1. 磷酸盐缓冲液（pH7.4）：甲液：1/15 mol/L磷酸氢二钠溶液：称取磷酸氢二钠（Na2HPO4）9.47g（或Na2HPO412电0 2 3 .87 g ）溶于蒸馏水,定容至1 000 ml。乙液：1/15 mol/L磷酸二氢钾溶液：称取磷酸二氢钾（KH2PO4）9.078g，溶于蒸馏水，定 容至 1 000 ml。取甲液825 ml,乙液175 ml,混合，测其pH为7.4即可使用。2. GPT基质液：称取a -酮戊二酸29.2 mg及DL -丙氨酸1.78g，溶于pH7.

26、4的磷 酸盐缓冲液20ml中，溶解后再加缓冲液70ml,并移入100ml容量瓶内。加1mol/L的NaOH 溶液0.5ml，校正pH至7.4。再以pH7.4的磷酸缓冲液定容至100ml。贮存于冰箱备用，可用 1 周。3. GOT基质液：称取a -酮戊二酸29.2 mg及DL -天冬氨酸2.66g,溶于pH7.4的 磷酸盐缓冲液20ml 中,溶解后再加缓冲液70ml,并移入100ml容量瓶内。加1mol/L的NaOH 溶液0.5ml，校正pH至7.4。再以pH7.4的磷酸缓冲液定容至100ml。贮存于冰箱备用，可用 1 周。4. 2,4 -二硝基苯井溶液：称取2,4 -二硝基苯井20mg，先溶于

27、10ml浓盐酸中（可 加热助溶），再以蒸馏水稀释至100ml （有沉渣可过滤），棕色瓶内保存。5. 丙酮酸标准液（1ml=2p mol丙酮酸）：精确称取丙酮酸钠22mg，溶解后转入100ml 容量瓶中，用磷酸缓冲液（1/15 mol/L, pH7.4）稀释至刻度。6. 0.4 mol/L氢氧化钠溶液。7. 血清8柠檬酸苯胺溶液：取柠檬酸50克溶于50ml蒸馏水中，再加苯胺50ml充分混合即成， 低温出现结晶时，可置于37C水浴中，待溶解后应用。（三）操 作1.标准曲线制作：取 6 支试管按下表操作。试剂（ml）123456丙酮酸标准液00.050.10.150.20.25GPT (GOT)基质

28、液0.50.450.40.350.30.25pH7.4磷酸缓冲液0.10.10.10.10.10.1水浴 37 C, 10min2, 4二硝基苯井溶液0.50.50.50.50.50.5水浴 37C， 20min0.4mol/L氢氧化钠溶液（ ml）5.05.05.05.05.05.0相当活性（单位数）空白100200300400500混匀后，在520nm波长处，以空白调“0”点，读取各管光密度。以单位值为横座标,光密度为纵座标，绘制标准曲线。2. G PT （GOT）测定：取2支洁净的试管按下表操作。试剂（ml）空白测定血清0.10.1G PT (GOT)基质液-0.5混匀，37 C水浴，6

29、0minG PT (GOT)基质液0.5-柠檬酸苯胺溶液（滴）112,4二硝基苯肼溶液0.50.5混匀，37 C水浴，20min0.4mol/L氢氧化钠（ml）5.05.0混匀，放置5min,在波长520nm处测定，以空白调“0”点，读取光密度。GPT测定不加柠檬酸苯胺溶液，其他操作方法同GOT测定法。（四）计 算1. 由所测得之光密度值直接查标准曲线，即可得知活性单位。2. 若用标准管法测定，可用丙酮酸标准液（1ml = 2“mol） 0.1m 1,按操作测知标准管光 密度，按下列方式计算结果：（测定管光密度/标准管光密度）X200 =转氨酶活性（单位数）/ 100ml血清实验5脂肪酸的卩-

30、氧化一酮体测定法（一）原理酮体包括乙酰乙酸、卩一羟丁酸和丙酮三种物质。在肝脏中，脂肪酸经卩一氧化作用生成 乙酰CoA。生成的乙酰CoA可经代谢缩合成乙酰乙酸，而乙酰乙酸既可脱羧生成丙酮，又可 经卩一羟丁酸脱氢酶作用被还原生成卩一羟丁酸，三种物质统称酮体。酮体为机体代谢的正常 中间产物，在肝脏中生成后须被运往肝外组织才能被机体所利用。在正常情况下，动物体内 含量甚微；患糖尿或食用高脂肪膳食时，血中酮体含量增高，尿中也能出现酮体。本实验用丁酸做底物，将之与新鲜的肝匀浆一起保温后，再测定其中酮体的生成量。因为在碱性溶液中碘可以将丙酮氧化为碘仿（CHI3）,所以通过用硫代硫酸钠（Na2S2O3） 滴定

31、反应中剩余的碘就可以计算出所消耗的碘量，进而可以求出以丙酮为代表的酮体含量。 有关的反应式如下：CH3COCH3+4NaOH+3I2CHl3+CH3COONa+3NaI+3H2Ol2+2Na2S2O3 Na2S4O6+2NaI根据滴定样品与滴定对照所消耗的硫酸钠溶液体积之差，可以计算由丁酸氧化生成丙酮 的量。（二）试剂及器材（1）10% （w/v）氢氧化钠溶液：称取10g氢氧化钠，在烧杯中用少量蒸馏水将之溶解后， 定容至 100ml。（2）0.1mol/L正丁酸溶液：称取13g碘和约40g碘化钾，放置于研钵中。加入少量蒸馏 水后，将之研磨至溶解。用蒸馏水定容到1000m l,在棕色瓶中保存。此

32、时可用标准硫代硫酸 钠溶液标定其浓度。（3）0.5mol/L正丁酸：取0.05ml正丁酸，用0.5mol/L氢氧化钠溶液100ml溶解即成。（4）0.1mol/L碘酸钾（KIO3）溶液：称取0.8918g干燥的碘酸钾，用少量蒸馏水将之溶 解，最后定容至 250ml(5) O.lmol/L硫代硫酸钠(Na2S2O3)溶液：称取25g硫代硫酸钠，将它溶解于适量煮沸 的蒸馏水中，并继续煮沸5mi n。冷却后，用冷却的已煮沸过的蒸馏水定容到1000ml。此时即 可用0.1mol/L碘酸钾溶液标定其浓度。(6) 硫代硫酸钠溶液的标定：将蒸馏水25m 1、碘化钾2g、碳酸氢钠0.5g、10%盐酸溶液 20

33、ml加入一支锥形瓶内。另取0.1mo1/L碘酸钾溶液25ml加入其中，然后用硫代硫酸钠溶液 将之滴定至浅黄色。再加入0.1%淀粉溶液2ml,然后继续用硫代硫酸钠溶液将之滴定至蓝色 消褪为止。另设一空白，其中仅以蒸馏水代替碘酸钾，其余操作相同。计算硫代硫酸钠溶液的浓度 所依据的反应式如下：5KI+KIO3+6HCI=3I2+6KCI+3H2OI2+2Na2S2O3=Na2S4O6+2NaI(7) 10%(v/v)盐酸溶液：取10ml盐酸，用蒸馏水稀释到100ml。(8) 0.1%(w/v)淀粉溶液：称取0.1g可溶性淀粉，置于研钵中。加入少量预冷的蒸馏水， 将淀粉调成糊状。再慢慢倒入煮沸的蒸馏水

34、90ml,搅匀后，再用蒸馏水定容至100ml。(9) 0.9%(w/v)氯化钠。( 10) 1/15mol/L、 PH7.7 磷酸缓冲液(A 液)1/15mol/L Na2HPO4 溶液：称取 Na2HPO4 2H2O1.187g,将之溶解于 100ml 蒸 馏水中即成。(B液)1/15mol/L KH2PO4溶液：称取KH2PO40.9078g，将之溶解于100ml蒸馏水将之 溶解，最后定容至 100ml。取A液90 ml、B液10 B液，将两者混合即可。(12)匀浆器(或搅拌机)、碘量瓶。(三) 操作 1肝匀浆的制备注1( 1 )将动物(如鸡、家兔、大鼠或豚鼠等)放血处死，取出肝脏。(2)

35、 用 0.9%氯化钠溶液洗去肝脏上的污血，然后用滤纸吸去表面的水分。溶液至总体积 为 10ml。2酮体生成( 1)取两个锥形瓶，编号，按下表操作。新鲜肝匀浆2.0预先煮沸的肝匀浆2.0PH7.7 的磷酸缓冲液3.03.00.5mol/L正丁酸溶液2.02.0碘量瓶编号AB试剂（ml） - .无蛋白滤液5.05.00.1mol/L 碘液3.03.010%NaOH3.03.02）加完试剂后摇匀，将碘量瓶于室温放置 10min。3）于各碘量瓶分别滴加 10%盐酸溶液，使各瓶中溶液中和到中性或微酸性（可用 PH试纸进行检测）。（4）用 0.02mol/L 硫代硫酸钠溶液滴定到碘量瓶中的溶液呈浅黄色时，

36、往瓶中滴加数滴 0.1%淀粉溶液，使瓶中溶液呈蓝色。（5）继续用0.02mol/L硫代硫酸钠溶液滴定到碘量瓶中溶液的蓝色消褪为止。（6）记录下滴定时所用去的硫代硫酸钠溶液毫升数，按下式计算样品中丙酮的生成量。 4结果与计算 根据滴定样品与对照所消耗的硫代硫钠溶液体积之差，可以计算由丁酸氧化生成丙酮的量。实验中所用肝匀浆中生成丙酮的量（m ol） = （A-B）XCX1/6A：为滴定样品A （对照）所消耗的0.02mol/L硫代硫酸钠溶液的毫升数。B：不滴定样品B所消耗的0.02mol/L硫代硫酸钠溶液的毫升数。C：硫代硫酸钠溶液的浓度（mol/L）注：1 肝匀浆必须新鲜，放置久则失去氧化脂肪酸

37、能力。2 三氯乙酸作用是使肝匀浆的蛋白质、酶变性，发生沉淀。3 碘量瓶作用是防止碘液挥发，不能用锥形瓶代替。实验6血清IgG的分离制备一盐析法（一）原理IgG是免疫球蛋白（Immunoglobulin,简称IgG）的主要成分之一，分子量约为15万16 万，沉降生活费数约为 7s。 IgG 是动物和人体血浆的重要成分之一。血浆蛋白质的成分多达 70余种，要从血浆中分离出IgG,首先要进行尽可能除去其他蛋白质成分的粗分离程序，使 IgG在样品中比例大为增高，然后再纯化而获得IgG。盐析法是粗分离蛋白质的重要方法之一。许多蛋白质在纯水或低盐溶液中溶解度较低， 若稍加一些无机盐则溶解度增加，这种现象称

38、为“盐溶”（Salting in）。而当盐浓度继续增加到 某一浓度时，蛋白质又变得不深而自动析出，这种现象称为“盐析（Saltingout）。这些现象 的原理大致是由于蛋白质是亲水胶体，带有羧基解离的负电荷或氨基解离的正电荷，其极性 基团使分子间相互排斥，同时与水分子形成水膜，这些因素保证蛋白质形成溶于水的溶胶状 态。当加入少量盐时，增多了蛋白质分子上的极性基团，因而增大了蛋白质在水中溶解度， 出现“盐溶”现象。钽当盐浓度增加到一定浓度时，一方面大量的水同盐分子结合，使得蛋 白质没有足够的水维持溶解状态，破坏了维持蛋白质亲水胶的水膜，容易沉淀出来；另一方 面加入的盐离子中和了蛋白质分子相互磁撞

39、时即发生相互聚集沉淀出来，这样就出现了“盐 析”现象。由于各种蛋白质“盐析”出来所需的盐浓度也各异，盐析所需的最小盐量称做盐 析浓度。盐析法就是通过控制盐的浓度，使蛋白质混合溶液中的各个成分分步“盐析”出来 达到分离目的蛋白质。盐析法是 1878 年 Hammarster 首次使用的，他用硫酸镁成功地将血清蛋白分成为清蛋白、 球蛋白两部分。自那以后曾使用过硫酸钠、氯化钠、磷酸钠和硫酸铵等中性盐来盐析蛋白质， 其中运用最广的是硫酸铵。因为硫酸铵有许多其他盐所不具备的优点，如在水中化学性质稳 定；溶解度大，25C时能达到4.1mol/L的浓度；溶解度的温度系数变化较小，在030C范围 内溶解度变化

40、不大，如25C时饱和溶解度为4.12mol/L,艮卩767g/L, 0C时饱和溶解度为 3.9mo 1/L,即676g/L。而且硫酸铵价廉易得，分段效果比其他盐好，性质温和，即使浓度很高 时也不会影响蛋白质的生物学活性。因此，现在所指的盐析法实际上多为硫酸铵盐析法。用硫酸铵分级盐析蛋白质时，盐析出某种蛋白质成分所需的硫酸铵浓度一般以饱和度来 表示。实际工作中将饱和硫酸铵溶液的饱和度定为100%或 1。盐析某种蛋白质成分所需的硫 酸铵数量折算成100%或1饱和度的百分之几，即秒为该蛋白盐析的饱和度。饱和度可以根据 情况用下述两种方法计算。1饱和硫酸铵溶液法 在蛋白质溶液的总体不大，要求达到饱和度

41、在 50%以下时，可 选用此方法。在已知盐析出某各蛋白质成分所要过到饱和度时，可按下列公式计算出应加入 饱和硫酸铵溶液的数量：C - C C - CV = V 24 或 V = V210 100-C0 1-C22式中：v0蛋白质溶液的原始体积；C2所要达到硫酸铵饱和度；C原来溶液的硫酸铵饱和度；V应加入饱和硫酸铵溶液的体积。将计算所得体积的饱和硫酸铵溶液加入到混合蛋白质溶液中，即可达到盐析的目的。严 格讲，混合两不同溶液时，混合后的总体积并不等于混合前两种溶液体积之和，而上式中是 按相等于计算的，所以会产生误差。但实验证明所造成的误差一般小于20%，故可忽略不计。2固体硫酸铵法所需达到的饱和度

42、较高，而蛋白质溶液的体积又不能再过分增大时，采用直接加入固体硫酸铵的方法。欲达到某到饱和度可按下列公式计算出应加入固体硫酸铵 的数量：v G(C - C )G(C - C )X =2+ 或 X =2昇100-AC1-AC22X是将1L饱和度为C1溶液提高到饱和度为C2时，需要加入固体硫酸铵的重量(g)o G和 A 为常数，数值与温度有关。现在已将达到各种饱和度所需固体硫酸铵的数量列成表，使用时不需计算可直接从表中查出。市售固体硫酸铵中一般残留有硫酸，所以制备的饱和硫酸铵溶液的PH常在4.5 5.5之间,作用之前应该用氢氧化铵调节，使其PH为7。用固体硫酸铵盐析时，蛋白质应溶解于具有一 定缓冲能

43、力的溶液中，并且在加入硫酸铵中还含有一些重金属离子，用量大时易使蛋白质变 性，在这种情况下可加入一些EDTA等螯合剂以螯合这些金属离子。硫酸铵盐析法可使蛋白质的纯度提高约5倍，而且可以除去DNA，RNA等。但盐析后的 蛋白质中仍含有一些杂蛋白，所以盐析产生的产品为粗分离产品需要进一步纯化。本实验中 利用离子交换层析法纯化。在离子交换层析之前，由于盐析所得的蛋白质中含有大量硫酸铵 将影响离子交换层析。所以，在层析之前需要“脱盐”。“脱盐”有凝胶过滤法和透析法，本 实验将采用凝胶过滤法。(二) 试剂与器材(1) 饱和硫酸铵溶液：取化学纯(NH4)2SO4800g，加蒸馏水1000ml,不断搅拌下加

44、热 至5060C，并保持数分钟，趁热过滤，滤液在室温中过夜，有结晶析出，即达到100%饱和 度，作用时用浓NH4OH调至PH7.0。(2) 0.01mol/L，PH7.0，磷酸盐缓冲溶液：取 0.2mol/L Na2HPO4溶液 61.0ml, 0.2 mol/LNa2HPO4溶液39.0ml,混合，用酸度计检查PH应为7.0。取该混合液50ml,加入7.5gNaCl, 用蒸馏水 1000ml。（3）0.0175mol/L, PH.7,磷酸盐缓冲溶液：取 0.2 mol/L Na2HPO4溶液 43.5ml 与 0.2 mol/L Na2HPO4溶液56.5ml相混合，用酸度计检查PH应为6.

45、7。取该混合液87.5ml,用蒸馏水稀释 至 1000ml。（三）操作（1）在1支离心管中加入5ml血清和5ml 0.01mol/L, PH7.0磷酸盐缓冲液，混匀。用皮 头滴管吸取饱和硫酸铵溶液,边滴加边搅拌于血浆溶液中,使溶液的最终饱和度为 20%（应 加入饱和硫酸铵溶液多少毫升？）,用滴管边加边搅拌,是为防止饱和硫酸铵1 次性加入或搅 拌不均匀造成局部过饱和的现象,使盐析达不到预期的饱和度,得不到目的蛋白质。搅拌时 不要过急以免产生过多泡沫，致使蛋白质变性。加完后应在4C放置15min,使之充分盐析（蛋 白质样品量大时，应放置过夜）。然后以3000r/min离心10min。弃去沉淀（沉淀

46、为纤维蛋白原）， 在上清液中为清蛋白、球蛋白。（2）量取上清液的体积,置于另一离心管中,用滴管继续在上清液中滴加饱和硫酸铵溶 液，使溶液的饱和度达到50% （应加饱和硫酸铵溶液多少毫升？）加完后在4C放15min, 以3000r/min离心10min,清蛋白在上清液中，沉淀为球蛋白。弃去上清液，留下沉淀部分。（3）将所得的沉淀再溶于5ml0.01mol/L, PH7.0磷酸盐缓冲液中。滴加饱和硫酸铵溶液， 使溶液的饱和度达35% （应加入饱和硫酸铵溶液多少毫升？）。加完后4C放置20min,以 3000r/min离心15min, a,卩球蛋白在上清液中，沉淀为IgG。弃去上清液，即获得粗制的I

47、gG 沉淀。为了进一步化，操作（3）可得12次。将获得的粗IgG沉淀溶解于2ml0.0175mol/L, PH6.7 磷酸盐缓冲液中备用。实验 7 凝胶层析法脱盐和分离蛋白质（一）原理凡盐析所获得的粗制蛋白质（盐析得到的IgG ）中均含有硫酸铵等盐类，这类将影响以后 的纯化，所以纯化前均应除去，此过程称为“脱盐”（desalthing）。脱盐常用透析法和凝胶过 滤法,这两种方法各有利弊。前者的优点是透析后析品终体积较小,但所需时间较长,且盐 不易除尽；凝胶过滤法则能将盐除尽，所需时间也短，但其凝胶过滤后样品体积较大。所以， 要根据具体情况选择使用。前实验中样品体积较小，凝胶达滤后样品体积不会太

48、增加，所以 选用凝胶过滤法。（二）试剂与器材（ 1 ） Sephadex G-25。（2）0.0175mol/L, pH6.7 磷酸盐缓冲液。（3）奈氏（Nessler）试剂：于500ml锥形瓶内加入碘化钾150g，碘110g，汞150g及蒸 馏水100ml。用力振荡715min,至碘的棕色开始转变时，混合液温度升高，将此瓶浸于冷 水内继续振荡，直到棕色的碘转变为带绿色的碘化钾汞液为止。将上清液倾入2000ml量筒内， 加蒸馏水至2000ml,混匀备用。（4）20% （W/V）磺基水杨酸溶液。（5）1.5cmX20cm 层析柱。（ 6）黑、白比色磁盘。(三) 操作(1) 取层析柱1支(1.5c

49、mX20cm),垂直固定在支架上，关闭下端出口。将已经溶胀好 的 Sephadex G-25 中的水倾倒出去，加入 2 倍体积的 0.0175mol/L， pH6.7 磷酸盐缓冲液，并搅 拌成悬浮液，然后灌注入柱，打开柱的下端出口，继续加入搅匀的Sephadex G-25，使凝胶自 然沉降高度到17cm左右，关闭出口。待凝胶柱形成后，在洗脱瓶中加入0.0175mol/L, pH6.7 磷酸盐缓冲液以3 倍柱体积的磷酸盐缓冲流过凝胶柱，以平衡凝胶。(2) 凝胶平衡后，用皮头滴管除去凝胶柱面的溶液，将盐析所得全部IgG样品加到凝胶 柱表面，打开柱下口，控制流速让 IgG 样品溶液慢慢浸入凝胶内。凝

50、胶柱面上加一层的 0.0175mol/L, pH6.7磷酸盐缓冲液，并用此缓冲液洗脱，控制流速为0.5ml/min左右。用试管 收集洗脱液，每管10滴。(3) 在开始收集洗脱液的同时检查蛋白质是否已开始流出。为此，由每支收集管中取出1 滴溶液置于黑色比色磁盘中，加入1 滴20%磺基水杨酸，若呈现白色絮状沉淀即证明已有蛋 白质出现，直到检查不出白色沉淀时，停止收集洗脱液。( 4 )由经检查含有蛋白质的每管中，取1 滴溶液，放置在白色比色盘孔中，加入1 滴奈 氏试剂，若呈现棕黄色沉淀说明它含有硫酸铵。合并检查后不含硫酸铵的各管收集液，即为 “脱盐”后的 IgG。注意：在检测时，用皮头滴管吸取管中溶

51、液后应及时洗净，再吸取下一管，以免造成相 互污染假象。附：凝胶过滤法原理及基本操作1 原 理凝胶过滤(gel filtration),又称为凝胶层析(gel chromatography)、分子筛过滤(molecular sieve filtration)、凝胶渗透层析(gel osmotic chromatography)等。它是20世纪60年代发展起 来的一种层析技术。其基本原理是利用被分离物质分子大小不同及固定相(凝胶)具有分子 筛的特点，将被分离物质各成分按分子大小分开，达到分离的方法。凝胶是由胶体粒子构成的立体网状结构。网眼里吸满水后凝胶膨胀呈柔软而富于弹性的 半固体状态。人工合成的

52、凝胶网眼较均匀地分布在凝胶颗粒上有如筛眼，小于筛眼的物质分 子均可通过，大于筛眼的物质分子则不能，故称为“分子筛”。凝胶之所以能将不同分子的物 质分开是因为当被分离物质的各成分通过凝胶时，小于筛眼的分子将完全渗入凝胶网眼，并 随着流动相的移动沿凝胶网眼孔道移动，从一个颗粒的网眼流出，又进入另一颗粒的网眼， 如此连续下去，直到流过整个凝胶柱为止，因而流程长、阻力大、流速慢；大于筛眼的分子 则完全被筛眼排阻而不能进入凝胶网眼，只能随流动相沿凝胶颗粒的间隙流动，其流程短、 阻力小、流速快，比小分子先流出层析柱；小分子最后流出。分子大小介于完全排阻不能进 入或完全渗入凝胶筛眼之间的物质分子，则居中流出

53、。这样被分离物质即被按分子的大小分 开。用于凝胶层析的凝胶均为人工合成的产品，主要有交联葡聚糖(商品名为 Sephadex)、 琼脂糖(商品名为Sepharose)、聚丙烯酰胺凝胶(商品名为Bio - gel)及具有一定网眼的细玻 璃珠等和这些凝胶的衍生物。下面主要介绍葡聚糖凝胶，这是由葡萄糖的多聚物与1-氯- 2、3-环氧丙烷交连而成。 环氧丙烷引入丙三醇基将链状的多聚葡萄糖单位交联起来，凝胶网眼的大小由多聚葡萄糖的 分子和环氧丙烷的比例(交联度)来控制。葡聚糖具有较强的亲水性，在水和电解质溶液中膨胀成为柔软而富于弹性的凝胶，其吸 水能力与葡聚糖凝胶的交联度有密切关系。交联度大的，孔径小，吸

54、水少，膨胀的程度小； 交联度小的，孔径大，吸水多，膨胀的程度大。因此，葡聚糖凝胶孔径的大小可以其吸水量 的大小来表示，常以G-10至G-200号码标记。G后面的数字是其吸水量（毫升水/克干胶） 乘以10所得的值。如G-25即表示吸水量为2.5ml/2干胶。市售有G - 10、G-5、G - 50、G - 75、G - 100、G - 150、G - 200等型号。G - 75以上的胶因吸水量大，膨胀后形态柔软易变， 统称为软胶。G-75以下的称为硬胶。葡聚糖凝胶可分离的分子大小从几百到数十万。可根据被分离物质的分子大小及目的选 择使用。一般说Sephadex G - 1015通常用于分离肽及“

55、脱盐” Sephadex G - 75200用以 分离各类蛋白质。凝胶层析是一种物理分离法。葡聚糖凝胶基本上不带电荷呈多惰性，不与被分离物质发 生反应，所以分离的效果较好。然而由于它是葡萄糖的聚合物，因而仍有少量活性羟基，能 吸附少量蛋白质等被分离的物质。为了克服这个缺点，一般使用含有离子强度达0.08的NaCl 等中性盐缓冲液作洗脱液。2操作（1）凝胶溶胀（水化） 商品葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶均为干燥颗粒。使用前必须 水化溶胀。商品琼脂糖凝胶呈悬浮胶体可直接用，玻璃球不用溶胀。凝胶溶胀有两种方法：一种是将所需葡聚糖凝胶浸入蒸馏水中于室温下溶胀；另一种 是 置于沸水浴中溶胀。各种葡聚糖在上述

56、溶胀方法中所需的时间见下表：型号溶胀时间（小时）2025C分离范围（蛋白质，Mr）G-103至700G-153至 1500G-25310001500G-50315003000G-752430007000必须浸泡足够的时间以使凝胶充分溶胀。两种方法中，沸水浴溶胀不但节省时间，还可 以杀灭凝胶中污染的细菌并排出网眼中气体。凝胶溶胀后，需用蒸馏水洗涤几次，每次应将沉降缓慢的细小颗粒随水倾倒出去，以免 在装柱后产生阻塞现象，降低流速。洗后将凝胶浸泡在洗脱液中待用。一支层析柱中应该装入的干胶量可以用下法推算：称取1g所需型号的葡聚糖干胶，放在 5ml量筒中，用室温溶胀的方法充分溶胀，观察溶胀后凝胶的体积

57、。然后在层析柱中加水到所 需柱床高度，将水倒出，量取柱床体积。根据1g干胶溶胀后的体积和所需柱床体积，即可推 算出干胶的需要量。（2）装柱 将层析剂装入柱中进行层析的方法称柱层析法。作层析用的柱子称层析柱。 层析柱有玻璃和透明塑料的两种。柱子的一端为进口，另一端为出口，出口端底部有烧结玻 璃砂板或尼龙布，能阻止层析剂流出，溶剂则可流过。如果没有市售的层析柱，可以选用粗 细均匀，长短合适的玻璃管，在两端塞上合适的胶塞，胶塞中插人细玻璃管，在一端放一层 尼龙布为出口，即可作为层析柱使用。层析柱的长短粗细根据实验的目的而定，一般说来， 凝胶层析时柱越长，分离效果越好。但柱过长，层析时间长，样品易稀释

58、造成扩散，反而影 响分离效果。柱的内径不宜较细，直径1cm以下的柱易发生“管壁效应”即柱中部分的物质 组分移动较快，管壁周围的则移动较慢，造成分离混乱。当然柱的内径也不宜过粗。凝胶层析中，在把小分子物质（mwv1 500），如无机或其他物质与大分子物质 （mwv20 000）分离时，层析柱的体积一般约为样品的 4- 10 倍，高度与直径的比例为 5： 1 至 15： 1 之间。这类柱也称为“脱盐”柱，常用网孔很小的凝胶如G-25。用以将生物大分子物质彼此 分开的分级层析柱，体积应为样品体积的25100倍。柱长度与直径的比例为20： 1100： 1。装柱的操作过程如下：将层析柱垂直固定在支架上，

59、打开柱下口开关。将溶胀好的凝胶 放在烧杯中，使凝胶表面上的水层与凝胶体积相等。用玻璃棒搅匀凝胶液，顺玻璃棒灌入柱 内。此时柱下口一边排水，上口一边加入搅匀的凝胶，可见凝胶连续均匀地沉降，逐步形成 凝胶柱。当到达所需凝胶柱高度时，立即关闭下口，待凝胶自然沉降形成凝胶柱床。凝胶柱 床一般应离柱顶35cm，并覆盖一层溶液。灌注凝胶时要求将均匀的凝胶一直加到所需柱床高度，不能时断时续，否则将出现分层 或“纹路”等毛病。若中途出现这些现象，可以用玻璃棒将已形成的柱床逐步搅起，直至出 毛病的部分再让凝胶重新沉降或继续加入搅匀的凝胶悬液。若在灌好胶后才发现“纹路”、分 层等现象时，要重新装柱，以免影响层析效

60、果。在做大型的凝胶柱时，灌注的凝胶是否均匀 往往从表面上看不出来。所以使用前应该用一些带色的大分子物质如细胞色素C、血红蛋白或 专用的蓝色葡聚糖-2 000 (Blue dextran - 2 000)通过凝胶柱，观察形成的色斑带是否整齐， 若斑带歪斜，应该重新装柱，直至达到要求。刚从冰箱中取出的凝胶液，不能马上用来灌柱，应平衡至室温后再用，不然装好的凝胶 会产生大量的气泡影响层析。在整个灌注凝胶的过程及使用中，凝胶柱面上一定要覆盖着一层溶液，以免进入空气。 若进空气再加入溶液时，凝胶柱中易形成气泡。(3) 平衡 装好的凝胶柱，使用前应该用相当于柱床体积两倍或更多的洗脱液流过凝胶 柱，以压实凝

61、胶，称为平衡。(4) 上样 将样品加入到凝胶柱中，准备层析的过程称上样。上样时，应该注意上样量 的多少、样品的黏稠度及离子强度。这三个因素会影响到以后层析的效果。一般来说“脱盐” 层析时，上样体积可为柱体积的10%25%；生物大分子的分级分离，约为柱体积的1%5%。 样品的黏稠度一般不宜大于洗脱液黏稠度的 2 倍以上，不然洗脱峰会变宽和歪斜。离子强度 要达到 0.08，以免产生特异性吸附。上样操作：先打开层析柱的下口开关，放出凝胶柱面上的溶液，或用皮头吸管吸取，使 液面与凝胶表面相平齐，但切忌液面低于凝胶表面。然后将样品加在凝胶表面，打开柱下口 开关，控制流速，使样品慢慢渗入凝胶内。加样时注意勿将凝胶柱面冲起形成凹面，也不能 沿管壁流下，以免样品沿柱壁与凝胶柱的间凝胶隙漏下。当慢慢渗入凝胶的样品液液面与凝 胶柱面相平时，关闭下口，完成上样。然后在凝胶柱面上加一层(35cm)洗脱液，接上洗 脱瓶准备洗脱。(5) 洗脱 用规定的溶液流过样品，使分子量不同的样品逐步分开并先后由柱床流出的 过程称为洗脱。所用溶液称洗脱液。洗脱液放在贮液瓶(洗脱瓶)中并与层析柱相通连。洗 脱时只要打开层析柱下口开关，洗脱液即可流出。洗脱过程中保持恒定的流速是柱层析获得良好分离效果的重要条件