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1、第五章第五章 蛋白质工程蛋白质工程 第一节第一节 蛋白质工程概述蛋白质工程概述一、蛋白质工程的概念一、蛋白质工程的概念蛋白质工程，就是根据对蛋白质已知结构和功能的了解，借助计算机辅助设计，利用基因定点诱变等技术，特异性地对现有蛋白质结构基因进行改造，借以改善蛋白质的物理和化学性质，如提高蛋白质的热稳定性、酶的专一性等，或者利用化学和物理手段，对目标基因按预期设计进行修饰和改造，合成新的蛋白质的技术手段，并可以借此对蛋白质的结构与功能的关系进行更加深入的研究。第五章第五章 蛋白质工程蛋白质工程 二、蛋白质概述二、蛋白质概述（一）蛋白质的组成（一）蛋白质的组成组成蛋白质分子的化学元素主要有碳（50
2、%55%）、氢（6%7%）、氧（19%24%）和氮（13%19%）。组成人体蛋白质的氨基酸仅有20种，其中除甘氨酸和脯氨酸外，均属于L-氨基酸，其结构通式如下（R为侧链基团）（图5-1）：第五章第五章 蛋白质工程蛋白质工程 （二）蛋白质的结构（二）蛋白质的结构蛋白质的一级结构蛋白质的二级结构蛋白质的三级结构蛋白质的四级结构第五章第五章 蛋白质工程蛋白质工程 （三）蛋白质结构与功能的关系（三）蛋白质结构与功能的关系1.蛋白质一级结构与功能的关系蛋白质一级结构与功能的关系(1)相似的结构具有相似的功能(2)不同结构具有不同的功能2.蛋白质空间结构与功能的关系蛋白质空间结构与功能的关系空间结构发生改
3、变，其功能活性也必然会随之改变。第五章第五章 蛋白质工程蛋白质工程 第二节第二节 蛋白质工程的研究方法蛋白质工程的研究方法一、蛋白质工程的研究策略一、蛋白质工程的研究策略蛋白质工程的研究过程就是在对目标蛋白质的“结构功能”关系深入理解的基础上，通过严格的分子设计，把它定向地改造成一个具有预期的新的特性的蛋白质。这类研究中一般有两种情况：一种是对天然蛋白质进行改造；另一种是完全重建一个自然界原来没有的新的蛋白质。第五章第五章 蛋白质工程蛋白质工程 二、改变现有蛋白质的结构二、改变现有蛋白质的结构目前，蛋白质工程侧重于改造现有的蛋白质这一领域，主要通过“小改”和“中改”技术来实现。（一）小改（一）
4、小改少数几个氨基酸残基的替换少数几个氨基酸残基的替换小改是指对已知结构的蛋白质进行少数几个氨基酸残基的替换。定点突变是目前蛋白质工程研究的主要技术手段。（二）中改（二）中改分子剪裁分子剪裁分子剪裁是指在对天然蛋白质的改造中替换一个肽段或一个结构域。第五章第五章 蛋白质工程蛋白质工程 三、蛋白质全新设计三、蛋白质全新设计对蛋白质的全新设计所应用的技术手段是我们前面所提到的“大改”或“从头设计”工作。从头设计蛋白质是在人们认识蛋白质、掌握其结构规律并了解其结构功能关系的基础上进行的。同时它也是人们更加深入、全面认识蛋白质的一个过程，它的目的是人工创造出自然界中不存在的蛋白质分子，使之具有人们所需要
5、的特殊结构和功能，为人类所利用。目前该技术仍处于实验初级阶段。第五章第五章 蛋白质工程蛋白质工程 第三节第三节 蛋白质工程的应用实例蛋白质工程的应用实例一、胰蛋白酶一、胰蛋白酶胰蛋白酶（EC3.4.21.4）是丝氨酸蛋白酶类，它是一条单链肽，由223个氨基酸残基组成，N末端为异亮氨酸。它主要作用于精氨酸或赖氨酸羧基端的肽键。是特异性最强的蛋白酶，在决定蛋白质的氨基酸排列中，它成为不可缺少的工具。第五章第五章 蛋白质工程蛋白质工程 胰蛋白酶极易自溶，自溶产物经层析分离后，会得到4个具有胰蛋白酶活性的片段。通过对N末端残基的分析，表明这些活性产物是由于Arg117-Val118、Lys145-Se
6、r146及Lys159-Ala160处发生了断裂而出现的。人们运用了蛋白质工程手段，对Arg117位自溶点进行了缺失突变，最终得到了稳定性明显提高的突变株。第五章第五章 蛋白质工程蛋白质工程 二、金属硫蛋白二、金属硫蛋白金属硫蛋白(metallothionein,MT)是由微生物和植物产生的金属结合蛋白，是一类富含半胱氨酸的短肽，是半胱氨酸残基和金属含量极高的蛋白质，可以通过半胱氨酸的巯基结合大量的金属元素，对多种重金属有高度的亲和性。一般由两个大小相近、结构与功能类似的结构域组成，即-结构域和-结构域。人们为了在土壤中富集重金属元素，并提高植物对重金属的抗性，便将含有-结构域的基因转移到烟草
7、中，成功地获得了对镉、铜、铅等重金属具有较高抗性的工程株。第五章第五章 蛋白质工程蛋白质工程 三、人白细胞介素三、人白细胞介素-2-2IL-2是第一个被发现的白细胞介素。天然人白细胞介素-2是一个由133个氨基酸残基组成的多肽，133个氨基酸中共有3个半胱氨酸，其中有一个半胱氨酸（Cys125）以游离方式存在，而另两个半胱氨酸（Cys58和Cys105）缩合成活性所必需的二硫键。第五章第五章 蛋白质工程蛋白质工程 人们用蛋白质工程中的定位诱变技术将Cys125的密码TGT转换成TCT或GCA，使Cys125转换成丝氨酸或丙氨酸，避免了错误配对的产生。结果不但使IL-2的生物活性不受影响，而且其
8、热稳定性等方面也得到了较明显的改善。工程IL-2目前已被美国FDA批准上市，用于治疗肾细胞瘤。我国卫生部也已经批准了在国内试生产基因工程白细胞介素-2。第五章第五章 蛋白质工程蛋白质工程 四、组织纤维蛋白溶酶原激活因子四、组织纤维蛋白溶酶原激活因子tPA能够切割纤溶酶原形成纤溶酶，从而激活纤溶作用(fibrino1ysis)，使血栓溶解。作为一种高效特异性溶血栓药物。优点:(1)血栓选择性高但几乎不激活循环血液中的纤溶系统，可直接静脉注射；(2)对中毒性休克引起的弥散性血管内凝血疗效显著等。第五章第五章 蛋白质工程蛋白质工程 利用基因定点诱变技术，改变tPA分子中的某些糖基化氨基酸而减少或避免
9、了糖基化，有效地减缓了它在血浆中被清除的速率，达到了延长其半寿期的目的，临床应用价值得到有效提高。第五章第五章 蛋白质工程蛋白质工程 五、枯草杆菌蛋白酶五、枯草杆菌蛋白酶枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)是由枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)合成的一种丝氨酸蛋白酶。枯草杆菌蛋白酶根据来源的不同可分为Carlsberg、E、BL、YaB等多种。枯草杆菌蛋白酶可以催化蛋白质，把蛋白质水解成氨基酸。具有重要的应用价值，被广泛应用在洗涤剂、制革及丝绸工业中，是一种重要的工业用酶。三维结构及编码基因目前已经基本搞清楚，而且配有合适的克隆、表达系统以及准确的定量分析催化活性的方法，因此
10、缺点目前已经可以通过蛋白质工程得到改进。第五章第五章 蛋白质工程蛋白质工程 对枯草杆菌蛋白酶所做的定点诱变已有400多个，在理论和应用方面均取得了相当大的进展和成功。枯草杆菌蛋白酶早在几十年前就被开发成为商用的纺织品洗涤剂的添加酶，目前仍然是最基本、最重要，也是使用最广泛、最成熟的洗涤用酶。应用定点改造后的枯草杆菌蛋白酶制成的洗涤剂，便可以实现与漂白剂共同使用的目的了。另一方面枯草杆菌蛋白酶在作为蛋白质工程的研究对象过程中，不仅仅使它自身的诸多性能得到了改善；更为重要的是在研究它的过程中，蛋白质工程的研究理论同时也得到了大大的丰富，这为蛋白质工程技术应用于其他酶的研究，尤其是对其他工业酶的性能改造提供了非常珍贵的范例和理论指导。第五章第五章 蛋白质工程蛋白质工程 实训六实训六 胰蛋白酶酶活力的测定胰蛋白酶酶活力的测定第五章第五章 蛋白质工程蛋白质工程 第五章第五章 蛋白质工程蛋白质工程 第五章第五章 蛋白质工程蛋白质工程 第五章第五章 蛋白质工程蛋白质工程 第五章第五章 蛋白质工程蛋白质工程 第五章第五章 蛋白质工程蛋白质工程 第五章第五章 蛋白质工程蛋白质工程
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