生物电子显微术第一章教学文稿

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1、生物电子显微术第一章 Still waters run deep.流静水深流静水深,人静心深人静心深 Where there is life,there is hope。有生命必有希望。有生命必有希望生物电子显微术1绪论I.基本概念II.EM发展史III.EM分类及特点IV.电镜技术的应用V.各种显微镜性能与特点的比较2电子显微镜的基本知识I.TEM的结构和原理II.SEM的结构和原理5/9/202323超薄切片技术I.基本概念II.普通超薄切片技术4负染色技术5金属投影和复型技术I.金属投影技术II.复型技术6EM冷冻制样技术I.概述II.冷冻超薄切片技术III.冷冻断裂(蚀刻)及复型技术I

2、V.冷冻安全规则5/9/202337 SEM的样品制备技术I.概述II.SEM电镜的样品制备III.特殊样品的制备8电镜的应用(个案分析）I.花粉表面形态的SEM观察II.熏蒸固定真菌的SEM观察III.样品包埋块的制作IV.扫描电镜观察石蜡切片观察法V.植物原生质体超薄切片的制作VI.真菌菌丝及孢子的包埋5/9/202349X-ray显微分析I.X-ray微区分析的基本原理II.X-ray显微分析仪工作的基本原理III.X-ray显微分析的方法及应用10其他显微技术I.扫描隧道显微镜II.原子力显微镜III.激光扫描共焦显微镜IV.扫描电-声显微镜5/9/20235生物电子显微术I.课时安排

3、讲授：30学时实验：10学时II.主要内容：1.电镜的原理、结构（TEM，SEM）2.电镜的样品制备技术1)超薄切片技术4)金属投影及复型技术2)负染色技术5)SEM制样技术3)冷冻制样技术6)其他制样技术3.应用举例5/9/20236主要参考文献1.生物电子显微术 张景强 中山大学出版2.实用生物电子显微术 林钧安 辽宁科技出版3.生物电子显微术教程 陈力 北师大出版4.电子显微镜与电子光学 黄兰友 科学出版5.生物医学电子显微技术 程时 北医、协和6.生物学工作者实用生物电子显微术 英 G1976 参考文献1，2，3图书馆均有5/9/20237第一章 绪论1.1基本概念1.电子显微镜：简称

4、电镜利用电子束作为照明源，电磁透镜聚焦成像，并结合特定的机械装置，应用现代电子技术、高真空技术而制成的一种精密电子光学仪器。TEM：TransmissionElectronMicroscopeSEM：ScanningElectronMicroscope5/9/202382电子显微术：以电子显微镜为工具，对物质（样品）进行物理、化学、成分、超微结构等方面研究的一种技术。电子显微术定义:电子显微学是凝聚态物理、材料科学、乃至生命科学的交叉学科，是物质科学研究的一个重要组成部分。它是以电子显微学等方法,在原子尺度上对物质的微观结构进行研究分析,从而促进了新物质、新结构、新性能、新现象的发现，极大地推

5、动了新材料、新器件的发展。5/9/202393超微结构：指一般光学显微镜不能分辨的细微形态结构（亚显微结构），直至生物大分子结构（蛋白质、核酸、多糖、脂类）。4电子显微方法：ElectronMicroscopy指利用电子与固体样品作用时所发出的信息，对样品进行微区观察和分析的一种方法。1mm=103m1m=103nm1nm=101=10-10m5/9/2023101.2电子显微镜的发展概况I.光学显微镜的发展(LM:lightmicroscope)1.光镜的诞生人眼分辨率：人肉眼能分辨清楚的两点之间的最短距离用“”表示13世纪玻璃的发明制造眼镜、放大镜16世纪欧洲放大镜=0.01M=330倍1

6、590年荷兰眼镜商Hans之子-Janssen装配具有划时代意义的“显微镜”1665年英国物理学家RobertHook(虎克)第一台光学显微镜1675年荷兰Leeuwen.Hook(列文.贺克M=270倍,共研制247台光镜2.高倍率的光镜18世纪到19世纪中叶英、法、意相继研制消色差色差显微镜M=15002000人的视力提高了1000多倍0.2m5/9/2023113.光镜的局限性1878年德.理论光学家E.Abbe提出光镜的最优分辨率opt=0.4*光波的反射水波障碍物:石块产生的影子芦苇杆5/9/202312表1-1 电磁波各光谱区的一些参数及相应的结构分析方法5/9/202313可见光

7、波长40008000opt=0.4*光紫外线波长=3900130紫外线显微镜opt=1000X-ray=1000.5但无法偏转不能成像目前,光镜最好分辨率opt=0.160.32m1.结论:利用波长的更短光线做照明光源,可提高分辨率。（OR：波长越短，分辨率越高）电子波波长很短易于成像，从而导致电镜的产生和发展5/9/202314I.电镜的发展q国外情况1.电镜产生的三大理论基础Thomson（1897）证明电子的存在L.de.Broglie(德.1923)提出微观粒子的波粒二相性H.Busch(德.1926)建立几何电子光学理论1)电子的存在19世纪50年代德.波恩Geissler5/9/2

8、023151858年,Pluker(德.波恩物理学家),发现阴极射线1881年,Hertz(赫兹)只认识到阴极射线具有波动性1897年,Thomson证明阴极射线是带电粒子其荷质比为1011C/Kg1.波粒二相性法国.L.de.Broglie提出:一个动量为P,能量为E的自由运动的电子,相当于波长为=h/p,频率为V=E/h,并沿着粒子运动方向传播的平面波.电子束既有粒子性电子束既有粒子性,也有波动性也有波动性。5/9/2023161.几何电子光学理论电子光学：指研究和利用电子流的偏转、聚焦、成像规律的一门学科。1925年，柏林工学院M.knoll和A.Matthias尝试做聚焦的电子束透镜1

9、926年，H.Busch带有铁轭的短磁透镜聚焦理论D.gabor(M.knoll的学生）包壳透镜(1948年提出全息技术全息技术之父并获诺贝尔奖)1928-1929,Ernst.Ruska极靴磁透镜,现代磁透镜1.透射电镜的诞生1932年，M.Knoll和他的学生E.Ruska发明了电镜,放大倍数16倍;改进后75Kv,1.2万倍1939年,西门子制造第一台商品透射电镜1940年,Helmut.Ruska,研究噬菌体,建立第一个开放实验室1986年Ernst.Ruska和Gerd.Binnig、Heinirich.Rothrer获得诺贝尔物理奖5/9/2023173.扫描电镜的诞生1935年，

10、M.knoll设计第一台SEM1956年，二次电子探测器出现1956年，SEM商品化1.国内情况1.校外状况vTEM1953年，长春光机所第一台XD-100型100kvTEM1965年，中科院科仪厂DX-2型TEM100kv51970年，上海新跃仪表厂DXB1_12型TEM40万1977年，上海新跃DXB2_12型TEM80万2vSEM1975年，中科院科仪厂第一台SEMDX-3100DX-5601980年，中科仪KYKY-1000B1993年，中科仪KYKY-2000KYKY-2800KYKY-2800BKYKY-38005/9/202318vSTM(scanningtunnelingmic

11、roscope)1987年，中科仪、中科院化学所白春礼等研制第一台STMSSX-1型国产电镜的缺点：制造工艺粗燥、自动化程度低、清洁度差q我校情况1980sDX-2型TEM1996年，KYKY-2800型数字式扫描电镜q分辨率6nm，放大倍数10万5/9/2023191.3EM分类及特点I.透射电镜（TEM）1.原理：利用TE，整幅像同时成立，在荧光板上成象2.特点：样品超薄h1000二维平面像、立体感差分辨率高opt=2样品制备复杂3.观察对象：样品内部超微结构II.扫描电镜（SEM）1.原理：利用SE，逐点成像，显像管上成象2.特点：图象立体感强、可观察一定厚度的样品5/9/202320样

12、品制备简单，可观察较大的样品分辨率高，3040倍率连续可变，从4倍15万倍可配附件，进行微区的定量、定性分析1.观察对象：样品表面微观结构III.扫描透射电镜（STEM）I.兼顾SEM/TEM的特点、造价高、可观察较厚样品(0.204m)II.分辨率不如TEM高,高分辨型0.30.5nm;附件型1.53nmIII.在200KV时，辐射损伤小、污染小IV.能过检测到扫描透射电子，获取更多超微结构信息V.图像的反差和亮度易调节，切片可以不染色VI.显像方式：荧光屏、显像管VII.观察对象：表面、内部5/9/202321IV.超高压电镜（UHVEM:ultra-highvoltageelectron

13、microscope）HV500kv为超高压电镜，Hvmax=3MV其特点：穿透能力强、可观察较厚的样品m级分辨率高，2（晶格分辨率）单色性好，色差小，成像质量好辐射损伤小体积庞大、结构复杂、价格昂贵、需专用的防护装置观察对象：主要非生物材料的晶格结构、观察细胞骨架系统（微梁、微丝）5/9/202322I.分析电镜（AEM:analysiselectronelectronmicroscope)连续X-ray背底扣除能量：Z特征X-ray的能量特征X-ray波长：Z特征X-ray的波长1.波谱仪（WDS）Wavelength-dispersespectrometer微区定量分析，4Be92U慢2

14、060分，灵敏度高1.能谱仪（EDS）Energy-dispersespectrometer微区定性分析，11Na92U快23分，灵敏度低5/9/202323VI.低压扫描电镜（LVSEM:lowvoltage）HV=1Kv，可观察绝缘物质、生物样品试样不易发生充放电效应VII.生物分析电镜（BATEM:biologicanalysis）TEM+EDS（or：WDS）分辨率高=1.5、分析性能好VIII.扫描隧道显微镜（STM:scanningtunnelingmicroscope）I.M=1000万倍，水平1，垂直0.1II.可进行“活体”观察、可在大气、液体环境下直接观察物质表面特征III

15、.只能观察导体和半导体的表面结构、非导电的物质需要覆盖一层导电薄膜IV.STM主要用于研究表面科学、半导体材料、生命科学5/9/202324优点：优点：可在真空、大气、常温等不同环境下工作，甚至可将样品浸在水和其它溶液中，不需要特别的制样技术，并且探测过程对样品无损伤。这些特点适用于研究生物样品和在不同试验条件下对样品表面的评价，例如对于多相催化机理、超导机制、电化学反应过程中电极表面变化的监测等。STM在生物领域的应用：在生物领域的应用：STM在生物和有机材料一领域有着广泛的应用前景。尽管目前还存在着如何解释生物样品的STM图象、如何更好地制备生物样品以及选择合适衬底以沉积生物分子等问题，但

16、实际应用中已取得了不少好结果。例如在真空、大气和溶液条件下的DNA研究，球蛋白、胶原蛋白及红血球的研究等。STM在纳米科技中的应用：在纳米科技中的应用：STM不仅能够对样品表面进行成像，而且还能在纳米尺度上对材料表面进行刻蚀与修饰。由微观到宏观，即直接操纵单个原子和分子，对它们进行排列组合，以形成新的物质，或制造出一定功能的机器这是实现纳米加工的新思想，STM的出现使这一思想变为现实。自从STM问世以来，STM作为一种纳米加工的工具的研究已涉及到表面直接刻写、电子束诱导沉积以及单原子操纵等方面，并取得了一批高水平的研究结果。5/9/202325硅硅111面面7 7原子重构象原子重构象 硅片是大

17、家熟悉的制作晶体管和大规模集成电路的半导体材料，为了得到表面清洁的单质材料，要对硅片进行高温加热和退火处理，在加热和退火处理的过程中硅表面的原子进行重新组合，结构发生较大变化，这就是所谓的重构。5/9/202326液体中观察原子图象液体中观察原子图象 下图所示的是在电解液中得到的硫酸根离子吸附在铜单晶(111)表面的STM图象。图中硫酸根离子吸附状态的一级和二级结构清晰可见。5/9/202327 1990年，IBM公司的科学家展示了一项令世人瞠目结舌的成果，他们在金属镍表面用35个惰性气体氙原子组成“IBM”三个英文字母。5/9/202328 科学家把碳60分子每十个一组放在铜的表面组成了世界

18、上最小的算盘。与普通算盘不同的是，算珠不是用细杆穿起来，而是沿着铜表面的原子台阶排列的.5/9/202329 这是中国科学院化学所的科技人员利用纳米加工技术在石墨表面通过搬迁碳原子而绘制出的世界上最小的中国地图。5/9/202330DNA分子拉成的DNA图象5/9/202331I.原子力显微镜（AFM：atomicforcemicroscope)1.导电样品、非导电样品均可观察2.分辨率达到原子水平3.可以在真空、超高真空、电化学环境、常温低温条件下工作4.应用于表面科学、生命科学、材料科学注：以STM、AFM为基础，衍生出扫描探针显微镜（SPM：Scanningprobemicroscope

19、）：如激光力显微镜（LFM）、扫描电化学显微镜（SECM）5/9/202332X.环境扫描电镜（ESEM）1.特点：多种真空状态：高、低、超低真空1Torr=1mmHg柱压力=1/760大气压=133.3Pa粗真空：76010乇低真空：1010-3乇高真空：10-310-8乇超高真空：10-8乇以下多种真空条件下可得SE像、BE像，且=4nm样品室可充气体:水气、氮气动态分析：样品温度从-1851000制样简单：样品无须镀膜、脱水干燥真正的“环境”条件，可直接观察含水、含油样品2.缺点：造价太高$30万Philips低气压空间5/9/2023331.4电镜技术的应用I.生物科学方面：1.细胞生

20、物学2.分子生物学3.动物学和植物学4.微生物学II.医学科学1.基础医学2.临床医学III.农林畜牧科学1.植物保护2.良种繁育（遗传育种）3.土壤改良与成分分析4.动植物疾病的快速诊断与防治5/9/202334材料科学1.机械部件的疲劳、失效分析2.金属金相学3.建筑材料分析其他方面：矿产、地质与考古、海关、造纸、电池生产、物理学与化学、环境保护5/9/2023351.5各种显微镜性能与特点的比较种类LMTEMSEM照明源可见光电子束电子束透镜玻璃透镜电子透镜电子透镜最高分辨率0.10.2m（紫外显微镜）12（晶格）3（点）430100放大倍率1200010080万720万焦点深度浅(50

21、0倍时2m)中(500倍时500m)深(500倍时1000m)特征 表一5/9/202336种类LMTEMSEM视场100mm(1)2mm(100)10mm(10)图象色彩有无无显相方式直接观察荧光屏显象管样品种类切片、涂片切片、复型膜,涂片各种实体样品厚度厚（数微米）极薄1000不限样品环境空气真空真空 续表一 特征5/9/202337树立正确的人类认识观I.DM机体器官解剖水平（宏观）II.LM细胞细胞水平（微观）III.EM亚细胞分子结构分子水平（超微观）EM的发展趋势I.一般形态定量定性1.X-ray分析2.电子衍射3.俄歇电子能谱4.能量分散谱仪II.二维平面三维立体图象重组III.

22、静态描述动态观察IV.EM+计算机信息处理5/9/202338思考题I.电镜和光镜有何异同？II.你知道有那几类电镜？试简述各自特点及其用途。III.电镜中，可否用X-ray取代电子光源？试分析其原因。5/9/2023395/9/2023405/9/2023415/9/2023425/9/2023435/9/2023445/9/2023455/9/2023465/9/2023475/9/2023485/9/2023495/9/2023505/9/2023515/9/2023525/9/2023535/9/2023545/9/2023555/9/2023565/9/2023575/9/2023585/9/2023595/9/2023605/9/2023615/9/2023625/9/2023635/9/2023645/9/2023655/9/2023665/9/2023675/9/2023685/9/2023695/9/2023705/9/2023715/9/2023725/9/2023735/9/2023745/9/2023755/9/2023765/9/2023775/9/2023785/9/2023795/9/202380