芯片数据预处理方法.pptx

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1、基因芯片数据预处理 分 类4个 技术 环 节 基 因 芯 片 （ gene chip） ， 又 称 DNA微 阵 列 （ microarray） ， 是由 大 量 DNA或 寡 核 苷 酸 探 针 密 集 排 列 所 形 成 的 探 针 阵 列 ， 其 工 作 的 基本 原 理 是 通 过 碱 基 互 补 配 对 检 测 生 物 信 息 。实 验 要 求 ： 单 通 道 一 张 芯 片 检 验 一 种 状 态 ；双 通 道 差 异 表 达 基因 的 筛 选储 存 的 生 物 信 息 ： 寡 核苷 酸 芯 片 （ 常 为 单 通道 ） 、 cDNA芯 片 （ 常 为双 通 道 ）基 因 芯 片

2、制 备 样 品 制 备 mRNA提 取 等杂 交 反 应信 号 检 测 与 分 析 基因芯片的实验流程（双通道） 单 通 道 /双 通 道 基 因 芯 片 实 例 杂 交 完 成 后 ， 要 对 基 因 芯 片 进 行 “ 读 片 ” ， 即 应 用 激 光 共 聚 焦 荧 光 扫描 显 微 镜 ， 对 基 因 芯 片 表 面 的 每 个 位 点 进 行 检 测 。 基 因 芯 片 数 据 分 析 ： 对 从 基 因 芯 片 高 密 度 杂 交 点 阵 图 中 提 取的 杂 交 点 荧 光 信 号 进 行 定 量 分 析 ， 通 过 有 效 数 据 筛 选 和 相 关 基 因表 达 谱 聚 类

3、 ， 发 现 基 因 的 表 达 谱 和 功 能 之 间 的 联 系 。探 针荧 光 值 基 因表 达 值 计 算 机 “ 读 片 ” 机 理 cDNA芯 片 、 载 有 较 长 片 段 的 寡 核 苷 酸 芯 片 采 用 双 色 荧 光 系 统 ： 目 前 常 用 Cy3一 dUTP（ 绿 色 ） 标 记 对 照 组 mRNA， Cy5一 dUTP（ 红 色 ） 标 记 样 品 组 mRNA 用 不 同 波 长 的 荧 光 扫 描 芯 片 ， 将 扫 描 所 得 每 一 点 荧 光 信 号 值 自 动 输 入 计算 机 并 进 行 信 息 处 理 ， 给 出 每 个 点 在 不 同 波 长

4、下 的 荧 光 强 度 值 及 其 比 值 ， 同时 计 算 机 还 给 出 直 观 的 显 色 图 。 在 样 品 中 呈 高 表 达 的 基 因 其 杂 交 点 呈 红 色 ， 相 反 ， 在 对 照 组 中 高 表 达 的基 因 其 杂 交 点 呈 绿 色 ， 在 两 组 中 表 达 水 平 相 当 的 显 黄 色 ，这 些 信 号 就 代 表 了 样 品 中 基 因 的 转 录 表 达 情 况 。 将 样 品 中 的 DNA/RNA标 上 荧 光 标 记 ， 则 可以 定 量 检 验 基 因 的 表 达 水 平 。 数 据 预 处 理 分 析 流 程 ： 算 法（ 以 cDNA芯 片

5、为 例 ）探 针 水 平 数 据 获 得 （ 计 算 机 扫 描 图 像 ）数 据 预 处 理 ： 背 景 处 理 、 数 据 清 洗 、 提 取 表 达 值 、 标 准 化 、 汇 总获 取 基 因 表 达 数 据 ： 判 断 差 异 基 因 表 达聚 类 和 分 析 1 探 针 水 平 数 据 （ probe-level data） 的 获 得 提 取 生 物 样 品 的 mRNA并 反 转 录 成 cDNA， 同 时 用 荧 光 素 或 同 位 素 标 记 。 在 液相 中 与 基 因 芯 片 上 的 探 针 杂 交 ， 经 洗 膜 后 用 图 像 扫 描 仪 捕 获 芯 片 上 的 荧

6、 光 或 同 位素 信 号 ， 由 此 获 得 的 图 像 就 是 基 因 芯 片 的 原 始 数 据 （ raw data） ， 也 叫 探 针 水 平数 据 。 获 取 探 针 水 平 的 数 据 是 芯 片 数 据 处 理 的 第 一 步 ， 然 后 需 要 对 其 进 行 预 处 理 （pre-processing） ， 以 获 得 基 因 表 达 数 据 （ gene expression data） 。 基 因 表 达 数 据是 芯 片 数 据 处 理 的 基 础 。 基 因 芯 片 探 针 水 平 数 据 处 理 的 R软 件 包 有 affy, affyPLM, affycom

7、p, gcrma等 。 2 预 处 理2.1 背 景 （ background） 处 理 背 景 处 理 即 过 滤 芯 片 杂 交 信 号 中 属 于 非 特 异 性 的 背 景 噪 音 部 分 。 一般 以 图 像 处 理 软 件 对 芯 片 划 格 后 ， 每 个 杂 交 点 周 围 区 域 各 像 素 吸 光 度 的平 均 值 作 为 背 景 ， 但 此 法 存 在 芯 片 不 同 区 域 背 景 扣 减 不 均 匀 的 缺 点 。 也可 利 用 芯 片 最 低 信 号 强 度 的 点 （ 代 表 非 特 异 性 的 样 本 与 探 针 结 合 值 ） 或综 合 整 个 芯 片 非 杂

8、 交 点 背 景 所 得 的 平 均 吸 光 值 做 为 背 景 。 背 景 处 理 之 后 ， 我 们 可 以 将 芯 片 数 据 放 入 一 个 矩 阵 中 ： 其 中 ， 各 字 母 的 意 义 如 下 ：N： 条 件 数 ；G： 基 因 数 目 （ 一 般 情 况 下 ， GN） ；行 向 量 mi=(mi1 ,mi2 ,miN)表 示 基 因 i在 N个 条 件 下 的 表 达 水 平 （ 这 里指 绝 对 表 达 水 平 ， 亦 即 荧 光 强 度 值 ） ；列 向 量 mj=(m1 j,m2 j,mGj)表 示 在 第 j个 条 件 下 各 基 因 的 表 达 水 平（ 即 一

9、张 芯 片 的 数 据 ） ；元 素 mij表 示 第 基 因 i在 第 j个 条 件 下 （ 绝 对 ） 基 因 表 达 数 据 。 m可 以是 R（ 红 色 ， Cy5 ， 代 表 样 品 组 ） 。 也 可 以 是 G（ 绿 色 ， Cy3 ,代 表 对 照组 ） 。 2 .2 数 据 清 洗 （ data cleaning） 经 过 背 景 校 正 后 的 芯 片 数 据 中 可 能 会 产 生 负 值 ， 还 有 一 些 单 个 异 常 大 （ 或 小 ） 的峰 （ 谷 ） 信 号 （ 随 机 噪 声 ） 。 对 于 负 值 和 噪 声 信 号 ， 通 常 的 处 理 方 法 就 是

10、 将 其 去 除 ，常 见 数 据 经 验 型 舍 弃 方 法 有 ： 标 准 值 或 奇 异 值 舍 弃 法 ； 变 异 系 数 法 ； 前 景 值 200；前 景 值 -平 均 数 /前 景 值 -中 位 数 80%等 等 。 然 而 ， 数 据 的 缺 失 对 后 续 的 统 计 分 析 （ 尤其 是 层 式 聚 类 和 主 成 分 分 析 ） 有 致 命 的 影 响 。 Affy公 司 的 芯 片 分 析 系 统 会 直 接 将 负 值修 正 为 一 个 固 定 值 。 对 数 据 的 删 除 ， 通 常 是 删 去 所 在 的 列 向 量 或 行 向 量 。 一 个 比 较 常 用

11、的 做 法 是 ， 事先 定 义 个 阈 值 M。 若 行 （ 列 ） 向 量 中 的 缺 失 数 据 量 达 到 阈 值 M， 则 删 去 该 向 量 。 若 未达 到 M， 有 两 种 方 法 处 理 ， 一 是 以 0或 者 用 基 因 表 达 谱 中 的 平 均 值 或 中 值 代 替 ， 另 一个 是 分 析 基 因 表 达 谱 的 模 式 ， 从 中 得 到 相 邻 数 据 点 之 间 的 关 系 ， 据 此 利 用 相 邻 数 据 点估 算 得 到 缺 失 值 （ 类 似 于 插 值 ） 。 填 补 缺 失 值 （ k临 近 法 ） ： 利 用 与 待 补 缺 基 因 距 离 最

12、 近 的 k个 临 近 基 因 的 表 达 值 来 预 测 待 填 补 基 因 的 表 达 值 。 根 据 邻 居 基 因 在 样 本 中 的加 权 平 均 估 计 缺 失 值 。 2 .3 提 取 表 达 值 由 于 芯 片 数 据 的 小 样 本 和 大 变 量 的 特 点 ， 导 致 数 据 分 布 呈 偏 态 、 标 准 差 大 。对 数 转 换 能 使 上 调 、 下 调 的 基 因 连 续 分 布 在 0的 周 围 ， 更 加 符 合 正 态 分 布 ， 同 时对 数 转 换 使 荧 光 信 号 强 度 的 标 准 差 减 少 ， 利 于 进 一 步 的 数 据 分 析 。 cDN

13、A芯 片 ： 对 双 通 道 数 据 使 用 Cy5（ 红 ） 和 Cys3（ 绿 ） 两 种 荧 光 标 记 分 别 标 记case和 control样 本 的 cDNA序 列 。 扫 描 仪 采 用 两 种 波 长 对 基 因 芯 片 的 图 像 进 行 扫描 ， 根 据 每 个 点 的 光 密 度 值 计 算 相 对 应 的 绝 对 表 达 量 (intensity)； 然 后 图 像 分析 软 件 通 过 芯 片 的 背 景 噪 音 以 及 杂 交 点 的 光 密 度 分 析 ， 对 每 个 点 的 intensity校准 ， 利 用 Cy5/Cy3的 值 获 取 case与 cont

14、rol组 不 同 基 因 的 表 达 值 ratio（ （ R/G ratio） ； 一 般 选 择 以 2为 底 的 对 数 转 化 数 据 ， 比 如 R/G=1， 则 log 2R/G=0， 即 认为 表 达 量 没 有 发 生 变 化 ， 当 R/G=2 或 者 ， R/G=0.5， 则 log值 为 1 或 1， 这 是 可以 认 为 表 达 量 都 发 生 两 倍 的 变 化 。 以 下 的 数 据 处 理 都 是 对 log2R/G的 形 式 进 行 分 析 。 2 .4 归 一 化 经 过 背 景 处 理 和 数 据 清 洗 处 理 后 的 修 正 值 反 映 了 基 因 表

15、达 的 水 平 。 然 而 在 芯 片 试 验 中 ，各 个 芯 片 的 绝 对 光 密 度 值 是 不 一 样 的 ， 在 比 较 各 个 试 验 结 果 之 前 必 需 将 其 归 一 化（ normalization， 也 称 作 标 准 化 ） 。 数 据 的 归 一 化 目 的 是 调 整 由 于 基 因 芯 片 技 术 引 起 的 误 差 ， 不 是 调 整 生 物 RNA 样 本 的 差 异 。在 同 一 块 芯 片 上 杂 交 的 、 由 不 同 荧 光 分 子 标 记 的 两 个 样 品 间 的 数 据 ， 也 需 归 一 化 。 常 用 的标 准 化 方 法 有 “ 看 家

16、 基 因 法 ” 、 基 于 总 光 密 度 的 方 法 、 回 归 方 法 、 比 率 统 计 法 等 。 比 率 统 计 法 此 方 法 用 于 标 准 化 同 一 块 芯 片 上 杂 交 的 两 种 样 品 ， 并 且 建 立 于 以 下 的 假 设 之 上 ： 在 近似 的 两 个 样 品 中 ， 虽 然 基 因 有 上 调 和 下 调 ， 但 一 些 基 本 的 基 因 （ 如 管 家 基 因 ） 的 表 达 量 是近 似 相 同 的 。 由 此 得 出 一 个 近 似 概 率 密 度 公 式 ： 比 率 T =R /G（ R 和 G分 别 是 芯 片 上 第 K个 点 的 红 光

17、和 绿 光 的 强 度 ） ， 经 过 迭 代 算 法 处 理 得 到 一 个 平 均 表 达 比 率 及 其 可 信 限 ， 用 于 数 据的 标 准 化 计 算 。 常 用 的 方 法 是 平 均 数 、 中 位 数 标 准 化 (mean or median normalization)：将 各 组 实 验 的 数 据 的 log ratio 中 位 数 或 平 均 数 调 整 在 同 一 水 平 。 中 位 数 标准 化 ： 将 每 个 芯 片 上 的 数 值 减 去 各 自 芯 片 上 log Ratio值 的 中 位 数 ， 使 得所 有 芯 片 的 log Ratio值 中 位

18、数 就 变 成 了 0， 从 而 不 同 芯 片 间 logRaito具 有 可比 性 。 3 差 异 基 因 表 达 分 析 经 过 预 处 理 ， 探 针 水 平 数 据 转 变 为 基 因 表 达 数 据 。 为 了 便 于 应 用 一 些 统 计 和数 学 术 语 ， 基 因 表 达 数 据 仍 采 用 矩 阵 形 式 。 倍 数 分 析 方 法 ： 倍 数 变 换 fold change， 单 纯 的 case与 control组 表 达 值 相 比 较 ，对 没 有 重 复 实 验 样 本 的 芯 片 数 据 ， 或 者 双 通 道 数 据 采 用 这 种 方 法 （ 该 方 法

19、是 对 基因 芯 片 的 ratio值 从 大 到 小 排 序 ， 即 cy5 /cy3 比 值 ， 一 般 0 .5 -2 .0 之 间 内 的 基 因 不 存 在差 异 表 达 ， 范 围 之 外 存 在 差 异 表 达 。 缺 点 是 倍 数 选 取 具 有 任 意 性 ， 可 能 不 恰 当 ） 参 数 法 分 析 （ t检 验 ） ： 当 t超 过 根 据 可 信 度 选 择 的 标 准 时 , 比 较 的 两 样 本 被 认为 存 在 着 差 异 。 但 小 样 本 基 因 芯 片 实 验 会 导 致 不 可 信 的 变 异 估 计 ， 此 时 采 用 调 节性 T检 验 。 非

20、参 数 分 析 ： 由 于 微 阵 列 数 据 存 在 “ 噪 声 ” 干 扰 而 且 不 满 足 正 态 分 布 假 设 ，用 t检 验 有 风 险 。 非 参 数 检 验 并 不 要 求 数 据 满 足 特 殊 分 布 的 假 设 ， 所 以 可 使 用 非参 数 方 法 对 变 量 进 行 筛 选 。 如 经 验 贝 叶 斯 法 、 芯 片 显 著 性 分 析 SAM法 。 常 用 的 利 用 R的 limma包 使 用 t检 验 筛 选 差 异 表 达 基 因 ，利 用 R的 siggenes包 使 用 SAM方 法 筛 选 差 异 表 达 基 因 。 False Discovery

21、Rate (FDR) 在 基 因 芯 片 的 实 验 中 ， 每 一 个 基 因 /探 针 ， 都 是 一 个 独 立 的 实 验 。 基 因 芯片 ： 高 通 量 ， 1,000个 基 因 /探 针 。 因 此 ， 无 论 怎 么 比 较 ， 总 会 有 一 些 基 因会 是 统 计 显 著 性 差 异 表 的 可 能 是 随 机 产 生 的 。 如 何 评 估 表 达 差 异 基 因 预 测 的 有 效 性 ？ FDR = p-value * No. of Genes 例 ： 1,000个 探 针 的 双 通 道 芯 片 ， 以 p-value 0.01为 域 值 ， 发 现 7个 上 调

22、 基因 ， 5个 下 调 基 因 ， 分 析 结 果 是 否 具 有 统 计 学 意 义 ？ 计 算 ： FDR= 0.01* 1,000=10 (随 机 ) 。 7个 上 调 基 因 ， 5个 下 调 基 因 10， 因 此 上 例 计 算 的 结 果 无统 计 学 意 义 。 FDR必 须 远 小 于 发 现 的 差 异 表 达 基 因 数 目 。 另 一 种 常 用 基 因 芯 片 寡 核 苷 酸 表 达 谱 芯 片 的 数 据 预 处 理 ： 由 于 探 针 长 度较 短 （ 20-25bp） ， 采 用 匹 配 /失 配 探 针 对 方 法 ， 即 设 计 一 个 特 异 的 寡 核

23、 苷 酸 （ PM匹 配 ） 、 同 时 设 计 一 个 非 特 异 性 的 寡 核 苷 酸 探 针 （ MM失 配 ） ， 该 探 针 仅 仅 在 中间 位 置 有 一 个 碱 基 替 换 。 用 PM与 MM之 间 的 差 值 作 为 信 号 强 度 ， 来 解 决 寡 核 苷 酸之 间 非 特 异 性 杂 交 的 噪 声 影 响 。 一 般 设 计 11-20对 探 针 来 检 测 一 个 转 录 本 。 寡 核 苷 酸 芯 片 与 cDNA芯 片 的 数 据 预 处 理 差 别 主 要 集 中 在 转 录 表 达 值 的 获 取 ，即 如 何 将 11-20对 探 针 值 转 化 为

24、单 个 转 录 的 表 达 值 呢 ， 常 用 三 种 预 处 理 方 法 ， 即MAS、 RAM法 、 MBEI法 。 MAS方 法 将 芯 片 分 为 k（ 默 认 值 为 16） 个 网 格 区 域 ， 用每 个 区 域 使 用 信 号 强 度 最 低 的 2%探 针 去 计 算 背 景 值 和 噪 声 。 R M A , 该 方 法 使 用 回旋 ( convolution) 模 型 计 算 出 芯 片 的 非 特 异 杂 交 背 景 均 值 , 然 后 以 P M 值 减 去 该 均 值 获 得 校 正 的 P M 值 , 再 以 对 数 相 加 模 型 计 算 转 录 的 表 达 值 。 使 用 软 件 提 取 表 达 值 ： R的 affy包 ReadAffy()函 数 可 以 读 取 Affy公 司 出 的 CEL格 式寡 聚 核 苷 酸 芯 片 原 始 数 据 ， 并 使 用 exprs函 数 ()查 看 表 达 值 。 了 解 芯 片 预 处 理 的 原 理 和 步 骤 后 ， 完 全 可 以 用 一 个 R函 数 完 成 数 据处 理 得 到 表 达 值 ， 如 Affy包 提 供 的 处 理 函 数 expresso( )。