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1、酪蛋白内容提要：蛋白质是由氨基酸构成的高分子化合物。蛋白质同氨基酸一样是两性电解质，调节蛋白质溶液的pH值可使蛋白质分子所带的正负电荷数目相等，即溶液中的蛋白质以兼性离子形式存在，在外加 电场中既不向阴极也不向阳极移动。这时溶液的pH值称为该蛋白质的等电点。在等电点条件下，蛋白质 溶解度最小，因此就会有沉淀析出。牛乳中主要含有酪蛋白和乳清蛋白两种蛋白质，其中酪蛋白占了牛 乳蛋白质的80%。酪蛋白是白色、无味的物质。不溶于水、乙醇及有机溶剂，但溶于碱溶液。牛乳在 pH 4.7时酪蛋白等电聚沉后剩余的蛋白质统称乳清蛋白。乳清蛋白不同于酪蛋白，其粒子的水合能力强、 分散性高，在乳中呈高分子状态。提取
2、到酪蛋白后，可以用双缩脲反应、茚三酮反应、黄色反应来鉴定 分析。关键词：酪蛋白 制备 定性分析 鉴定1、实验目的（1）学习从牛乳中制备酪蛋白的原理和方法。（2）对酪蛋白进行分析鉴定。2、实验原理牛乳中主要的蛋白质是酪蛋白，含量约为35g/L。酪蛋白食一些含磷蛋白质的混合物， 等电点为 4.7。利用等电点时溶解度最低的原理，将牛乳的pH调至4.7时，酪蛋白就沉淀出来。用乙醇洗涤沉淀 物，除去脂类杂质后便可得到纯的酪蛋白。双缩脲：尿素加热至180 C左右，生成双缩脲并放出一分子氨。双缩脲在碱性环境中能与铜离子结 合生成紫红色化合物，此反应称为双缩脲反应。蛋白质分子中有肽键，其结构与双缩脲相似，也能
3、发生 此反应。可用于蛋白质的定性或定量测定。茚三酮反应：一切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫色物质，但能与茚三酮呈阳性反应的不一定就 是蛋白质或氨基酸。在定性、定量测定中，应严防干扰物存在。反应分为两步，第一步是氨基酸被氧化 形成二氧化碳、氨分子和醛，水合茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原型茚三酮同另 一个水合茚三酮分子和氨缩合生成有色物质。反应的适宜pH为5 7，同一浓度的蛋白质或氨基酸在 不同pH条件下的颜色深浅不同，酸度过大时甚至不显色。3、实验试剂、材料与器材3、1试剂与材料牛奶、95%乙醇、无水乙醚、乙醇-乙醚混合液(乙醇：乙醚=1: 1 V/V )、0.2mol/L醋酸
4、-醋酸钠缓冲液(先配制A液与B液。A液：0.2mol/L醋酸钠溶液 称醋酸钠晶体54.44g，定容至2000mL。B液：0.2mol/L醋酸溶液称优级纯醋酸年(含量大于99.8%)12.0g定容至1000mL。取A液1770mL，B液1230mL混合即得pH4.7的醋酸-醋酸钠缓冲液3000mL。)2%卵清蛋白溶液、10%氢氧化钠溶液、茚三酮溶液、甘氨酸溶液、苯酚溶液、浓硝酸溶液、色氨酸 溶液3、2器材离心机、精密pH试纸、烧杯、抽滤装置、电炉4、实验内容4、1酪蛋白的制备(1) 将25mL牛奶加热至40 C。在搅拌下慢慢加入预热至40 C、pH4.7醋酸缓冲液25mL。用精密试纸或 酸度计调
5、pH值至4.7。将上述悬浮液冷却至室温。离心15min(3000r/min)。弃去清液，得酪蛋白粗制品。(2) 用水洗沉淀三次，离心10min(3000r/min)，弃去上清液。(3) 在沉淀中加入约10mL乙醇，搅拌片刻，将全部的悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤。用乙醇一乙醚混合液洗沉淀2次。最后用乙醚洗沉淀2次，抽干。(4) 取1g酪蛋白，称湿重，进行鉴定。加入100mL蒸馏水，制成1%酪蛋白溶液。4、2定性分析(1) 双缩脲反应：取两支洁净的试管编号为1、2，分别加入1mL酪蛋白溶液和1mL卵清蛋白溶液，再 分别加入2mL10%氢氧化钠和2滴硫酸铜溶液，观察现象。(2) 茚三酮反应：取三支洁净
6、的试管编号为1、2、3，分别加入1mL酪蛋白溶液、1mL卵清蛋白溶液 和1mL甘氨酸溶液，再分别加入0.5mL茚三酮溶液。用沸水浴加热12分钟，观察现象。(3) 黄色反应：项目1234材料(溶液)卵清蛋白酪蛋白苯酚色氨酸用量(滴)4444浓硝酸(滴)24445、实验结果(1) 双缩脲反应：试管1溶液变为淡蓝色；试管2溶液变为淡蓝紫色。(2) 茚三酮反应：试管1溶液变为淡蓝色；试管2溶液变为淡蓝色，试管3溶液变为 蓝紫色。(3) 黄色反应：试管1 出现白色沉淀；试管2出现黄色沉淀；试管3无明显现象；试 管4溶液变为黄色。参考文献 王秀奇、秦淑媛、高天慧、颜卉君主编，基础生物化学实验，高等教育出版社，2 0 0 6年，P125 130,P146 148。刑其毅等主编，基础有机化学第三版下册，北京高等教育出版社，2005年，P 983。杨荣武主编，生物化学原理，北京高等教育出版社，2 0 0 4年，P 10。
酪蛋白的初步鉴定
