思茅松HDR基因全长cDNA克隆与序列分析

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1、思茅松HDR基因全长cDNA克隆与序列分析王毅;周旭;毕玮;杨宇明;李江;王娟【摘要】1-hydroxy-2-methyl-2-(E)-butenyl-4-diphosphatereductase(HDR)catalyzes the last step of the 2C-meth-yl-D-erythritol-4- phosphate(MEP)pathway,1-hydroxy-2-methyl-2-(E)-butenyl-4-diphosphate reductase plays an important role in regulation of terpenes biosynthes

2、is.To explore the function of 1-hydroxy-2-methyl-2-(E)-butenyl-4-diphosphate reductase in Pinus kesiya var.langbianensis,and to study the role of 1- hydroxy-2-methyl-2-(E)-butenyl-4-diphosphate reductase in regulation of resin biosynthesis,the transcriptome of bark of Pinus kesiya var.langbianen-sis

3、 was sequenced by Next-Generation Sequencing.First,a fragment of 1-hydroxy-2-methyl-2-(E)-butenyl-4-diphos-phate reductase gene was obtained from Pinus kesiya var.langbianensis transcriptome after gene assemble and gene function annotation.The special primers were designed according to the fragment

4、of 1-hydroxy-2-methyl-2-(E)-bute- nyl-4-diphosphate reductase.RNA of inj ured bark was extracted by Trizol method.The full length gene of PkHDR was cloned from Pinus kesiya var.langbianensis by Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT- PCR) and rapid-amplification of cDNA ends (RACE).Bioi

5、nformation analysis showed that the obtained full cDNA se-quence of PkHDR had 1 876 bp.It was consisted of 1 464 bp open reading frame (ORF)which encoded 487 amino acid.Homology analysis indicated that the deduced PkHDR protein shared 99% identities with the 1-hydroxy-2-methyl-2-(E)-butenyl-4- dipho

6、sphate reductase came from Pinus densiflora.Subcellular localization and structural domain analysis showed that the transit peptide sequence (A1-A61)and multiple conserved functional sites (A143, A234,A288,A371)of plant HDR protein were found in the deduced coding sequence of PKHDR.Phylogenetic anal

7、-ysis revealed that the evolutionary relationship of PkHDR protein was the closest to Pinus densiflora HDR protein. Reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR)detection showed that PkHDR gene expression was up-regulated by wounding treatment.The full cDNA of PkHDR from Pinus kesiya var.

8、langbianensis was cloned and the reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR)showed that PkHDR was involved in regulation of resin biosynthesis in Pinus kesiya var.langbianensis.These results would provide important information to reveal the resin biosynthesis in Pinus kesiya var.langbia

9、nensis.And this study also can be applied in the research of the high yield of resin variety molecular breeding.%1-羟基-2-甲基-2-E-丁烯基-4-焦磷酸还原酶(HDR)是甲基 -D-赤藓醇-4-磷酸(MEP)途径中的最后一个酶，在植物萜类生物合成中起主控作用. 该研究根据思茅松(Pinus kesiya var.langbianensis )树皮转录组数据分析结果， 首先获得了思茅松HDR基因片段,然后根据所获得的基因片段设计特异引物，提取 受伤后的思茅松树皮的RNA,并运用

10、RT-PCR和RACE技术从思茅松树皮中克隆得 到完整的HDR基因(PkHDR)生物信息学分析表明：克隆获得的PkHDRI基因 cDNA全长序列为1876 bp,含有1个1464 bp的开放阅读框(ORF)編码487个 氨基酸同源性分析结果表明：思茅松HDR蛋白与赤松(Pinus densiflora)HDR蛋 白的相似性高达99%.亚细胞定位及结构域分析结果表明：思茅松PkHDR氨基酸 序列中包含转运肽序列(A1-A61)及植物HDR蛋白多个保守的功能位点(A143,A234,A288,A371)系统进化分析结果表明：PkHDR蛋白与赤松HDR蛋白 的亲缘关系最为接近半定量PCR检测结果表明

11、：树皮的创伤促进思茅松HDR基 因的表达.该研究成功克隆获得HDR基因，并确定其与松脂代谢密切相关，为阐明思 茅松松脂生物合成机制和分子育种提供了参考.期刊名称】广西植物年(卷),期】2015(000)005【总页数】7页(P721-727)【关键词】思茅松;HDR;cDNA克隆;基因功能分析;半定量PCR【作 者】 王毅;周旭;毕玮;杨宇明;李江;王娟【作者单位】 云南林业科学院 国家林业局云南珍稀濒特森林植物繁育和保护重点 实验室，昆明 650201; 云南林业学科院，云南省森林植物培育与开发利用重点实 验室，昆明 650201;西南林业大学，昆明 650224;云南林业科学院国家林业局云

12、 南珍稀濒特森林植物繁育和保护重点实验室，昆明 650201; 云南林业学科院，云 南省森林植物培育与开发利用重点实验室，昆明 650201;云南林业学科院，云南 省森林植物培育与开发利用重点实验室，昆明 650201;云南林业学科院，云南省 森林植物培育与开发利用重点实验室，昆明 650201;云南林业学科院，云南省森 林植物培育与开发利用重点实验室，昆明 650201【正文语种】 中 文【中图分类】Q943.2松脂是重要的化工原料，其挥发性单萜和挥发性倍半萜以及非挥发性的二萜广泛应 用于化学，食品和医药等领域(Bohlmann et al. , 2008; Rodrigues et al.

13、 , 2013)。 思茅松(Pinus kesiya var.langbianensis)是云南省最主要产脂树种之一，其主要分 布在云南省普洱地区，具有生长快、松脂产量高等优点(徐明艳等，2012)。在生 产实践中发现思茅松个体松脂产量差异显著，单株年产量一般3 kg，最高可达 140 kg(徐明艳等，2012)。这意味着思茅松单位面积产脂量有巨大的提升空间。 我国自 20 世纪 80 年代始开展思茅松遗传改良研究，在种源试验、优良林分选择、 优树收集、无性系种子园建设、半同胞子代测定、早晚期性状相关及遗传变异等方 面开展了研究(张文勇等，2010)。姜远标等(2007)尝试利用现代分子标记辅

14、助思 茅松高产脂育种。但目前对思茅松松脂代谢过程中关键酶的研究尚未见有报道。所有萜类化合物，包括思茅松松脂主要成分都是以异戊烯基焦磷酸(IPP)和二甲基 烯丙基焦磷酸(DMAPP)为初始底物，在异戊二烯转移酶(FPP，GPP，GGPP)作用 下生成萜类化合物的各种前体，在萜烯合酶作用下生成单萜、二萜、倍半萜等 (Tholl，2006)IPP和DMAPP可以通过两个代谢途径独立合成，即位于细胞质 中的甲羟戊酸(MVA)途径和位于质体中的甲基-D-赤藓醇-4-磷酸途径(MEP)。其中， MEP途径的最终产物通常是单萜、二萜和四萜类化合物;而MVA途径的最终产物 通常是倍半萜、三萜类化合物(Laul

15、e et al. ,2003; Vranova et al., 2013)。李思 广等(2008)对思茅松高产脂个体的松脂化学组成特征分析发现思茅松所产松脂中 的主要成分为单萜和双萜化合物，而倍半萜的含量不到2%。因此，MEP途径对 思茅松松脂代谢具有重要意义。1-羟基-2-甲基-2-E-丁烯基-4-焦磷酸还原酶(HDR)是甲基-D-赤藓醇-4-磷酸(MEP) 途径中的最后一个酶，通过在大肠杆菌中超表达蓝细菌和植物中的HDR基因证明 了 HDR是萜类生物合成的限速酶(Wolff et al. , 2003)。相对于MEP途径中的另 夕卜一个限速酶，脱氧木酮糖-5-磷酸合酶(DXS) , HDR

16、在通过MEP途径提供前体 的萜类的生物合成中起到主控作用(Botella et al. , 2004)。Kim et al.(2009)研 究赤松松脂代谢时，发现HDR基因在转录水平的差异影响着赤松松脂的产量。本 文通过对思茅松转录组数据分析获得思茅松的HDR基因序列，利用RT-PCR和 RACE方法获得全长的思茅松HDR基因，并通过生物信息学方法对基因序列及推 导的氨基酸序列进行分析，为阐明思茅松松脂生物合成机制和分子育种提供参考。1 材料与方法1.1 材料 思茅松树皮采集于云南省普洱市景谷县半坡乡，按当地采松脂步骤，去除粗皮后， 将表皮以及形成层部分割下，迅速放入液氮中，并用液氮保存直到R

17、NA提取。PESY-T3克隆试剂盒及感受态细胞均购自北京全式金公司；LA-Taq酶、以及Reverse Transcriptase M-MLV 购自大连宝生物公司。1.2总RNA的抽提思茅松的树皮、松针、幼枝的RNA提取参照CTAB-LiCl沉淀法（Azevedo et al.， 2003汪雁等，2011）。改进的地方主要是在对RNA中的DNA消化，本实验采用 膜上消化的方式去除DNA。方法如下：将溶解的RNA用DEPC水补足200 pL 后，加入100 pL的无水乙醇，混匀后加入RNA Spin Column（宝生物，RNA提 取试剂盒），按照试剂盒步骤进行DNA消化，最终用30 pL洗脱液

18、进行洗脱。1.3思茅松HDR基因的3RACE由于转录组数据分析只得到思茅松HDR的片段，缺少3端的基因序列。因此，首 先以思茅松树皮的RNA为模板，按照3-Full RACE Core Set with PrimeScript RTase（TaKaRa）试剂盒说明书合成3端完整的思茅松cDNA第一链。根据获得的 HDR基因片段序列设计3RACE引物（表1），对思茅松HDR基因片段的3基因片 段进行克隆。1.4 cDNA 全长扩增依据cDNA拼接序列，设计HDR基因特异引物PkHDRF0和PkHDRR0（表1）, 以思茅松树皮的cDNA为模板，PkHDRFO和PkHDRRO为引物，扩增思茅松 H

19、DR基因cDNA开放阅读框全长序列。反应条件为94 C5 min;94 C30 s, 58 C45 s,72 C2 min, 30个循环;72 C延伸10 min。扩增的PCR产物胶回收 后连接到PEASY-T3载体中。并测序验证所克隆得到的全长cDNA。1.5思茅松HDR基因cDNA序列及其编码蛋白氨基酸的序列分析采用 NCBI( http : www.ncbi.nlm.nih.gov/)Blast 工具和 DNAMAN 软件将思 茅松HDR与数据库中其他植物HDR基因进行核酸和氨基酸的同源序列比对，多 序列的比对由ClusterW程序完成。并用MEGA 4.0.2软件的邻位相连算法 (Ne

20、ighborjoining)IOOO次自检举(boot straping)绘制出进化树图像。TargetP(www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)和 ChloroP(http : /www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/)被用来预测PkHDR蛋白的亚细胞定位以 及叶绿体转运肽的切割位点。1.6思茅松HDR基因表达分析以获得的PkHDR基因序列为模板设计特异引物FHDRt和RHDRt(表1)。将样品 液氮研磨后，用CTAB法分别提取思茅松的树皮1(除去粗皮后立即取样)，树皮 2(除去粗皮后12 h 取样,树皮3(除去粗皮后24 h 取样) ,

21、树皮4(除去粗皮后36 h取样)。并用琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量后，将RNA保存在-80 C超低温冰 箱。cDNA合成参照Reverse Transcriptase M-MLV试剂盒说明书操作(宝生物 工程有限公司，大连)，将cDNA保存在-20 C冰箱。以特异引物FHDRt和 RHDRt检测PkHDR基因的表达情况，同时以actin为内参。表1文中所用引物序列Table 1 Primers used in this study名称序列(5 3)用 途 NameSequence(5-3)Purpose 3RACHDRF1 CAATGATGCGTAGATTTGGTGTT3RACE 3RACHD

22、RF2CCACTCAGGAAAGACAAGATGCA PkHDRFO ATGGCTCAAGCGTGCGCGGT 开 全放长阅 c D 读 N 框 A 克隆 PkHDRRO CTATGCTGCTTGCAGAGCCTcDN CA Io nO eRF FHDFt ACGTGCAGTGCAAATTGCATRT 检-P 测 CR RHDRt ATCAAGCTTCTCCTTTACTAdR eT te-P ctC ioR n Factin ATTGCTGACCGTATGAGCART 内-P 参 CR Ractin TGAATACTAGCTAGCCTCAR cT o-nP trC oR I2 结果与分析2.1

23、 3RACE采用CTAB提取结合LiCl沉淀法（Azevedo et al.2003汪雁等，2011），提取思茅 松树皮以及松针的RNA，并用膜上消化的方式除去样本中的DNA，获得完整且纯 度高的RNA（图1）。2.2思茅松HDR全长cDNA的克隆与序列分析图1 HDR 基因克隆 M1.Trans2K DNA Marker; M2.TaKaRa 1K Marker;1.3RACE;2.HDR 全长 ORF 克隆。Fig.1 PCR product of HDR gene clone M1.Trans2K DNA Marker; M2.TaKaRa 1K Marker; 1.3RACE; 2.O

24、RF of HDR gene.通过对思茅松树皮转录组数据分析获得1 185 bp大小的HDR基因片段，根据该 片段设计特异引物，用RACE技术克隆目的基因的3cDNA末端，并进行测序验 证，结果表明其大小为685 bp（图1）。对获得的基因片段序列进行拼接后，获得全长cDNA序列为1 874 bp。利用软件 分析获得cDNA开放阅读框，并根据该序列设计含有起始密码子的特异引物 PkHDRF0和含终止密码子的特异引物PkHDRR0，并以思茅松树皮cDNA为模板， PCR扩增获得1 464 bp的cDNA完整的开放阅读框，并命名为PkHDR。将此1 464 bp片段与HDR cDNA拼接序列进行比

25、对分析，分析结果显示两序列一致， 这表明思茅松HDR基因cDNA拼接序列正确。其5含有45 bp的非编码区，3 端含有365 bp的非编码区，这表明成功克隆获得完整的思茅松HDR基因的 cDNA 序列（GenBank Accession No.KM382172）。2.3 PkHDR 氨基酸序列分析根据思茅松PkHDR基因cDNA全长序列推测其编码487个氨基酸残基，该基因 推断的蛋白与赤松（Pinus densiflora）以及火炬松（P.taeda） HDR蛋白的相似性为 99%。这说明HDR基因在松科中极其保守。以思茅松HDR氨基酸序列与来其他 四种不同物种的1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸

26、合酶氨基酸序列进行序列比对分析，推 测出PkHDR蛋白具有植物HDR蛋白催化过程中必需的4个半胱氨酸位点（A143， A234，A288，A371）（图2）。利用亚细胞定位软件以及叶绿体转运肽的切割位点 分析软件分析显示PkHDR的合成位于叶绿体内，其含有一个由61个氨基酸残基 构成的叶绿体转运肽（切割位点已用箭头标注，图2）。2.4 PkHDR 系统进化树分析思茅松HDR与其他植物的HDR氨基酸序列的系统进化分析表明：思茅松HDR 与松科的1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶聚为一类，从系统进化树可以看出思茅松 PkHDR与赤松的HDR基因及欧洲云杉（Picea abies）的 HDR的亲缘关

27、系较近（图 3）。2.5 PkHDR 基因的转录模式分析利用PkHDR基因的特异引物FHDRt和RHDRt，通过RT-PCR检测PkHDR在 模拟割脂过程中导致思茅松树皮受伤后，随着时间变化PkHDR基因表达情况。从 图4看出，PkHDR基因在创伤后（12、24、36 h）的表达量明显高于刚刚创伤时（0 h）的表达量。这说明对树皮的损伤会刺激PkHDR基因表达。3 讨论 思茅松是云南主要的产脂树种，也是中国重要的产脂树种，其树干富含树脂，其松 节油平均含量20%，最高可达32%，松节油中P-蒎烯含量高，为全国之最（徐明 艳等，2012)。在生产实践发现思茅松个体产脂差异巨大，经过多年研究积累确

28、定 思茅松个体产脂差异主要源于其个体的遗传性状上的差异(张文勇等，2010;李思广 等，2009)。思茅松生长周期漫长的特性，给传统数量性状的研究带来巨大的挑战 虽然国内已开展无性系种子园建设、半同胞子代测定、早晚期性状相关及遗传变异 等方面的工作，但并未解决思茅松高产脂机理的问题。大量的图位克隆结果表明数 量性状基因座在基因组上往往位于控制其性状的代谢通路上的酶基因上或者附近 (谭震波等，1996;Mackay et al. , 2009;Zorrilla et al. , 2011;Induri et al.,2012) 。因此，反向数量遗传学研究策略被提出来(Mauricio，2001)

29、，即从候选基 因(通常是与数量性状相关的代谢通路上的关键基因)出发，首先确定候选基因与数 量性状相关性，再对候选基因上下游序列进行研究，获得数量性状基因座进而阐明 数量性状基因调控机理(Salvi et al.，2005;Longhi et al.，2013)。特别是近年测 序技术的飞速发展，从候选基因出发，通过比较基因组上的差异获得大量数量性状 基因座(Harmegnies et al.，2006;Wang et al.，2011;Guggenheim et al.，2013) 。图2思茅松和其他物种HDR氨基酸序列比对分析PdHDR :赤松 (Acc54561);PtHDR :火炬松(AB

30、026588);TmHDR :曼地亚红豆杉(ABU44490); GbHDR：银杏(ABB78090)。所有蛋白序列中的保守氨基酸都用星号标注，有两 个变化的氨基酸位点用点标记。四个保守的半胱氨酸用灰色标注，其形成的键桥参 与了酶的催化，叶绿体转运肽切割位点根据比对结果分析用黑色三角形标注。Fig.2 Multiple alignment of deduced amino acid sequences of HDRs PdHDR.Pinus densiflora(ACC54561); PtHDR.Pinus taeda(ABO26588);TmHDR.Taxus media(ABU44490)

31、;GbHDR.Ginkgo biloba(ABB78090).Amino acid residues conserved among all sequences are marked with an asterisk;variability between two amino acid residues is marked with a dot.Four conserved cystein residues are highlighted with gray，which supposedly participate in the coordination of the iron-sulfur

32、bridge proposed to be involved in enzymatic catalysis.Dark triangle indicates the putative cleavage site deduced from the alignment result.1-羟基-2-甲基-2-E-丁烯基-4-焦磷酸还原酶(HDR)是MEP途径中的末端酶，催化1-羟基-2-甲基-2-E-丁烯基-4-焦磷酸(HMBPP)发生还原反应生成IPP和DMAPP。 近年通过异源表达以及超表达实验表明HDR基因在植物萜类生物合成中有重要作 用(Wolff et al.，2003;Botella et

33、 al.，2004;张雯等，2008)。特别是国外研究人 员通过基因表达实验证明HDR基因控制着赤松松脂的生物合成(Kim et al.， 2009)，这进一步证明HDR基因在松脂合成代谢中起着重要作用。通过比对分析 发现思茅松HDR基因与赤松HDR基因的相似度高达99%，只有三个氨基酸的差 异(A44，A473，A482)，与火炬松HDR相似度也高达98.97%，只有五个氨基酸 的差异(A24，A161, A421, A473，A482)。通过比较思茅松以及已经公布的其 他松科植物MEP途径中关键酶基因序列也显示出在蛋白序列具有高度保守性。这 暗示在松科MEP途径相关酶在进化上趋于保守，思茅

34、松个体产脂差异是相关基因 在转录水平上的差异导致而不是某个酶活性差异导致。通过RT-PCR检测思茅松 模拟割脂过程产生创伤后HDR表达情况发现，创伤能够有效地刺激HDR表达(图 4)。这与生产实践中割脂可以刺激松脂产生相吻合，说明HDR表达高低与产脂量 正相关。而对于不同个体在相同处理(创伤)的情况下，表现出不同的产脂量，这很 可能与个体中基因拷贝数以及关键酶基因所处染色体位置相关，即所对应的数量性 状基因座相关。图3 PkHDR与其他不同物种间HDR系统进化树邻近相接法构建的系统进化树是 用MEGA4软件基于已经在GenBank里公布的HDR构建。Fig.3 Phylogenetic tre

35、e of the HDRs The neighbor-joining tree was constructed using MEGA4 based on amino acid of 1-hydroxy-2-methyl-2-(E)-butenyl 4-diphosphate reductase which were published on GenBank.图4思茅松PkHDR在树皮创伤后表达情况用特异引物扩增基因片段后，并用1% 琼脂糖胶检测基因转录情况。Fig.4 RT-PCR analysis of PkHDR expression after wounding treatment.Tr

36、anscripts were amplified using gene specific primers，with the PCR products separated using 1%agarose gel.本文以普洱市景谷县半坡乡的思茅松“产脂王”(松脂年产量超过100 kg)为研究 对象，首先对其树皮转录组进行测序，然后通过转录组数据分析获得HDR基因序 列，并利用RACE等方法获得思茅松PkHDR基因全长序列，并将PkHDR完整的 开放阅读框克隆到载体PEASY-T3中。通过生物信息学分析确定其为1-羟基-2-甲 基-2-E-丁烯基-4-焦磷酸还原酶，同时，利用半定量PCR确认创伤正调

37、控PkHDR 基因表达，证明其与思茅松松脂合成相关。本研究为未来深入研究思茅松高低产脂 机理以及利用PkHDR基因培育思茅松新品种奠定基础。参考文献：Azevedo H，Lino T，Tavares RM.2003.An improved method for high- quality RNA isolation from needles of adult maritime pine treesJ.Plant Mol Biol Rep，21(4)：333338Bohlmann J，Keeling CI.2008.Terpenoid biomaterialsJ.Plant J，54(4)： 6

38、56669Botella P，Besumbes O，Phillips MA，et al.2004.Regulation of carotenoid biosynthesis in plants： evidence for a key role of hydroxymethylbutenyl diphosphate reductase in controlling the supply of plastidial isoprenoid precursorsJ.Plant J，40(2)：188199Guggenheim JA，McMahon G，Kemp JP，et al.2013.A geno

39、mewide association study for corneal curvature identifies the platelet-derived growth factor receptor alpha gene as a quantitative trait locus for eye size in white EuropeansJ.Mol Vis，19（1）：243253Harmegnies N，Davin F，De Smet S，et al.2006.Results of a wholegenome quantitative trait locus scan for gro

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