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1、吉林大学本科生毕业答辩 答辩题目： 人参 -香树素合成酶的同源模建及高 通量虚拟筛选抑制剂的研究 Homology Modeling and High-throughout Screening with Computer of a New Inhibitor of Panax -AS 答辩人： 07级生物技术 徐阳 指导老师：韩葳葳 副教授 内容提要 前言 同源模建建立 -AS三维结构 分子动力学模拟优化所建立的三维结构 抑制剂的结合位点的预测 高通量虚拟筛选 前言 人参皂苷简介 人参皂苷是人参的主要活性成分，至今已经发现 四十余种人参皂苷。人参皂苷具有抗炎、抗氧化作 用，还有广泛的抗肿瘤作用
2、。目前，人参皂苷已成 为医药、食品、轻工等行业的重要原料，随着对人 参皂苷生理活性研究的深入和中药现代化的要求， 对人参皂苷的需求量将会进一步上升。 提高人参皂苷产量的途径 寻找人参 -香树素合成酶 （ -AS）的高效抑制剂 经过对人参皂苷生物代谢途径的研究发现， 2,3 氧化鲨 烯的环化是植物固醇代谢途径与人参皂苷代谢途径的分支点。 经过 -AS的催化，最终产生了植物固醇。所以，如果能寻 找到 -AS的高效抑制剂，有效的抑制其活性，则能引导代 谢流向人参皂苷合成途径，可以提高人参皂苷的产量。 同源模建 -AS蛋白的序列已经得 知，于是我们将其序列提交 到 Swiss model的自动比 较蛋
3、白质模建服务器上，经 程序自动选择，选择了在甾 族化合物骨架形成中起重要 作用的人的氧化鲨烯环化酶， 并且以序列相似性为 41的 晶体结构 1W6J为模板 2， 直接生成了 -AS的初始三维 结构。 分子动力学模拟 在 2.2ns的 MD模拟过程中 RMSD随时间变化曲线 我们在初始的三维结构基 础上，利用 GROMACS程序对 其进行了分子动力学 2.2ns(MD)模拟。 由图可以看出， -AS体 系的 RMSD在 2ns 之后趋于不 变（ 0.35），体系已经稳定。 最终得到的 -AS的三维结 构 a为 -AS的最终结构， b为其表面能量 。 验证三维结构的可靠性 右图 显示了 - AS结
4、构中 QMEAN Z-scores。 QMEAN Z- scores表示蛋 白稳定性的预 测。经过分子 动力学模拟之 后， Z-scores 的值为 -6.16， 说明 -AS结构 稳定。 右图 显示的 是 Profiles-3D的分值。 经过分子动力学优 化后，各残基的兼 容性均有所提高。 而对于最终的结构 -AS，其所有残基 的得分均大于 0，这 说明所有的残基都 处于合理的位置。 综上， 经过两种不同的评估方法验证，说明 -AS 的结构是可靠的。 10-aza-10,11-dihydro-2,3-oxidosqualene 是与底 物 2,3-oxidosqualene 竞争型的抑制剂，
5、因此抑制剂 的结合位点是底物的结合位点。 秦玉芝等人认为在甾醇生物合成中的关键酶（包 括 -AS）的氨基酸序列中存在极度保守的部分（例 如 Leu252， Leu285），此外，目前没有任何其它 信息提供活性口袋所处的位置以及组成。通过 Binding-site模块搜寻活性口袋，搜寻到一处包含有 Leu252， Leu285的位点，可以确定为活性部位。 抑制剂结合位点的预测 高通量虚拟筛选 我们以 10-aza-10,11-dihydro-2,3-oxidosqualene作为先导 化合物通过建立的筛选策略进行筛选，从 ZINC数据库的 1300多万小分子中筛选出来的 120个小分子中，使用
6、AutoDockvina对 120个小分子分别与 -AS进行分子对接。选 择能量最低的小分子（化合物 8442257）做进一步的深入研 究。 a为抑制剂 10-aza- 10,11-dihydro-2,3- oxidosqualene的结 构； b为复合物 8442257； c为 -AS 与复合物 8442257的 分子对接模型； d为 -AS活性位点处的 一些残基与 8442257 之间的氢键。 将 8442257和 10-aza-10,11-dihydro-2,3-oxidosqualene放在 活性位点中 。 用 Gaussian03 AM1方法对其优化结构 ， 然后 用 Affinit
7、y软件对接 。 Ligand Ev dw(KJmol-1) Eele(KJmol-1) Etotal(KJmol-1) Ludi Score 8442257 -73.10 -2.59 -75.69 802 10-aza-10,11-dihydro-2,3-oxidosqualene -64.60 -0.40 -64.26 621 Table 1 The total energy Etotal, van-der-Waal energy Evdw and electrostatic Eele between inhibitors and -AS Ludi Score 从上表中看到，化合物 8442
8、257与酶相互作用时候，相互作用能比较低， 而 Ludi得分比较高，说明 8442257是比 10-aza-10,11-dihydro-2,3- oxidosqualene好的抑制剂。 8442257与 -AS酶活性口袋中的部分残基共形成 2个氢键，从而提高了 抑制剂的稳定性 8442257与 Ser413的羧基部分形成 1个氢键， Trp613 与 8442257形成了 1个氢键，所以 Ser413和 Trp613在抑制剂 8442257的 识别起到极为重要的作用。因此它们在 -AS中起到稳定抑制剂的作用。 分子间的非键相互作用对于确定抑制剂与酶之间的相对位置以及关键残 基非常重要，由于 -
9、AS的活性口袋较大，涉及氨基酸残基非常多，与 8442257活性位点残基之间的总相互作用能小于 -1 kJ/mol的残基及其相 互作用能列在下表表中。 Residues Evdw(KJmol-1) Eele(KJmol-1) Etotal(KJmol-1) Leu287 -9.81 -1.16 -10.97 Pro194 -5.88 -0.43 -6.31 Leu285 -6.06 0.08 -.7.39 Trp613 0.10 -5.69 -5.59 Gln288 -5.45 -0.07 -5.52 Ser413 -0.09 -5.28 -5.37 Tyr184 -5.09 0.14 -4.
10、94 Glu291 -4.19 -0.12 -4.51 Arg206 -3.17 0.31 -2.86 Glu290 -3.67 -0.01 -3.68 Tyr292 -2.11 -0.23 -3.34 Ile188 -2.33 0.55 -1.78 Met185 -1.47 -0.00 -1.47 Cys202 -0.72 -0.28 -1.00 The total energy Etotal, van-der-Waal energy Evdw and electrostatic Eele between 8442257 and individual residues of -AS 综上所述 ，从氢键和相互作用能两个方面来看， Leu287 Pro194, Leu285, Trp613, Gln288, Ser413, Tyr184, Glu291 Arg206,Glu290,Tyr292,Ile188,Met185,Cys202 这 14个氨基 酸残基在 -AS 中，对抑制剂 8442257都具有重要的作用。 我们的研究设计 -AS酶专有的抑制剂提供可靠的理论线索。
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