《实验动物操作》PPT课件.ppt

《《实验动物操作》PPT课件.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《《实验动物操作》PPT课件.ppt（83页珍藏版）》请在装配图网上搜索。

1、考试时间： 11月 12日 考试地点：图书馆电子阅览室 时间 三楼 二楼 8:30 1002-1261 1263-1312 9:30 1314-1472 1474-1541 10:30 1542-1751 1752-1904 一、尽量选择与人类相似的实验动物 1 结构和功能 的相似性 皮肤结构 人类 小猪 皮肤 2.0（ 0.5 3.0） 1.3 1.5 表皮 0.07 0.17 0.06 0.07 真皮 1.7 2.0 0.931.7 基底细胞层所处的深度 0.07 0.030.07 表皮和真皮厚度的比例 1： 24 1： 24 实验动物选择的基本原则 2 时象或年龄 状态的相似性 3 群体

2、分布 的相似性 与人群具有相似的自然群体基因的实验动物类 别为封闭群动物 。 4 生态或健康状况 的相似性 现有的不同微生物学质量级别的普通动物 、 清洁 动物 、 SPF动物 、 无菌及悉生动物分别代表着不同的微 生态模式并具有不同特点 ， 适用于不同研究目的 。 5 疾病特点 的相似性 6 解剖特点 的相似性 外科手术性的操作模型中或教学示教中 ， 体型大 的动物比体型小者在实践感上更接近人类 。 二、选用解剖、生理特点符合实验目的要求的实验动物 家兔颈部的交感神经 、 迷走神经和主动脉减压 神经 是独立行走的 ， 如要观察减压神经对心脏等作 用时 ， 须选用家兔； 家兔对体温变化十分灵敏

3、 ， 适于发热 、 解热和 检查致热原等实验研究； 三、根据实验动物不同品种、品系的特点选择 1、 吗啡 对兔、犬、猴起中枢抑制，而 小鼠和猫是中枢兴奋。 2、津白 1号为低癌系而津白 2号为高癌 系。 四、根据课题研究的目的、内容、水平，选用相匹配 的标准化动物 近交系 动物遗传的均质性及实 验反应的稳定性较封闭群动 物好 ， 但生存抵抗力差； 封闭群 动物能较好地代表自然 群体； F1杂交群 动物在一定程度上兼 有近交系及封闭群的特点 。 教学示范选用普通级动物， 清洁级动物 是国内科研工 作要求的标准动物，适合于大多数科研课题，而 SPF动物 则是国际标准的实验动物，对于一些具有国际交流

4、意义的 重大课题，最好选用 SPF动物，但 无菌及悉生动物 为非常 规动物，仅在特殊课题需要时才选用。 六、选用与实验要求相适应的实验动物规格 年龄： 应选择体成熟的青壮年动物为宜 。 体重： 实验动物体重与年龄间有一定的相关性 ， 选择发育正常 、 体重符合要求的实验动物 。 性别： 同一品种 （ 系 ） 动物不同性别对许多外界刺激的反应不 一致 。 生理状况： 不同生理状态对外界的刺激的反应不一致 。 七、经济性原则 八、动物实验结果的外推 九、实验动物的选择和应用应注意有关国际规范 动物实验基本技术和方法 第一节 实验动物的抓取与固定 第二节 实验动物性别鉴定和标志 第三节 实验动物血液

5、采集 第四节 实验动物麻醉方法 第五节 实验动物给药方法 第六节 安乐死 第一节 实验动物的抓取与固定 一、小鼠的抓取与固定 二、大鼠的抓取与固定 三、豚鼠的抓取与固定 四、兔的抓取与固定 五、犬的抓取与固定 六、猕猴的抓取与固定 第二节 性别鉴定和标记 一、性别鉴定 1、啮齿目 二、动物的标记 1、染色法 3% -5%苦味酸 溶液，可染 成 黄色 。 0.5% 中性红或品红 溶液 , 可染成 红色 。 2、耳号钳标记法 3、挂牌法 4、断趾编号 5、笼子编号 第三节 常规采血方法 一、小鼠采血 1剪尾采血 2摘除眼球采血 3眼眶采血 4、心脏采血 二、大 鼠 采 血 1、眼眶采血 2、股静脉

6、或股动脉采血 3、腹主动脉采血 三、家 兔 采 血 1、耳静脉采血 2、心脏采血 四、犬 采 血 1、前肢皮下头静脉或后肢小隐静脉采血 2、颈动脉采血 第四节 实验动物麻醉方法 1、呼入法：多选用 乙醚 作麻醉药。本法最适合于大、 小鼠的短期操作试验的麻醉。 2、腹腔或静脉给药麻醉法：硫喷妥钠、 戊巴比妥钠 、 氯胺酮、水合氯醛 第五节 实验动物给药方法 1、小鼠灌胃给药 将喂管顺咽后壁轻轻往下推，喂管会顺着食管滑入小 鼠的胃，插入深度约 3cm。 2注射给药 （ 1） 皮下注射给药 作皮下注射常选项背或大腿内侧的皮肤。将皮肤提 起，注射针头取一钝角角度刺入皮下，把针头轻轻向左 右摆动，易摆动

7、则表示已刺入皮下，再轻轻抽吸。注射 量约为 0.1-0.3ml/10g体重。 （ 2） 皮内注射给药 接种、过敏实验等一般作皮内注射。先将注射部位 的被毛剪掉，局部常规消毒，左手拇指和食指按住皮肤 使之绷紧，用 4.5针头穿刺，针头进入皮肤浅层，再向上 挑起并梢刺入，将药液注入皮内。注射后皮肤出现一白 色小皮丘，而皮肤上的毛孔极为明显。注射量为 0.1ml/ 次 。 （ 3） 肌肉注射给药 小鼠体积小，肌肉少， 很少采用肌肉注射。当给小 鼠注射不溶于水而混悬于油 或其他溶剂中的药物时，采 用肌肉注射。用药量不超过 0.1ml/10g体重。 (4)静脉注射给药 用 75%酒精棉球反复擦拭尾部 ,

8、以达到消毒和使尾 部血管扩张的目的 . 以左手拇指和食指捏住鼠尾两侧 , 使静脉更为充盈 , 右手持 4号针头注射器 ,使针头与静 脉平行 (小于 30 角 ),从尾巴的下 1/4处进针 , 注射量 为 0.05-0.1ml/10g体重。 （ 5） 腹腔注射 使鼠腹部朝上，鼠头略 低于尾部，在下腹部靠近腹 白线的两侧进行穿刺，保持 针尖不动， 回抽针栓，如无 回血、肠液和尿液 后即可注 射药液。注射量为 0.1- 0.2ml/10g体重。 家 兔 给 药 1、灌胃给药 使用开口器和导尿管灌胃。 2、静脉给药 先拔去注射部位的 被毛，用手指弹动或轻 揉兔耳，使静脉充盈， 右手持注射器连 6号针头

9、 尽量从静脉的远端刺入， 将药液注入，然后拔出 针头，用手压迫针眼片 刻。 3、涂布法给药 犬 给 药 灌胃给药 静脉注射 静脉注射多选 前肢内侧皮下头静脉 或 后肢小隐静脉 注射。 人与动物及各种动物间药物剂量的换算方法 Meeh-Rubner氏公式： A（体表面积， m2） =K W( 体重， g) 2 3 1000 K为常数，随动物不同而不同： 小鼠和大鼠 9.1 豚鼠 9.8 家兔 10.1 狗 11.2 猴 11.8 人 10.6 某利尿药大鼠灌胃给药时的剂量为 250mg/kg,试粗略估计狗 灌胃给药可以试用的剂量。 大鼠体表面积 A=9.1 200 2 3 1000=0.0311

10、 m2 250 0.2 0.0311=1608mg/m2 狗体表面积 A=11.2 10000 2 3 1000=0.5198 m2 1608 0.5198 10=84mg/kg 动物种类 Meeh-Rubner氏 公式 K值 mg/kg- mg/m2转 换因子 每 kg体重占有体表相 对比值 小鼠 9.1 3 1.0（ 0.02 kg ） 大鼠 9.1 6 0.47（ 0.20 kg ） 豚鼠 9.8 8 0.40（ 0.40 kg ） 兔 10.1 12 0.24（ 2.0 kg ） 狗 11.2 19 0.16（ 10.0 kg ） 猴 11.8 12 0.24（ 3.0 kg ） 人

11、10.6 35 0.08（ 50.0 kg ） 250 6（大鼠转换因子） 19（犬转换因子） =79mg/kg 250 0.16（犬体表面积比值） 0.47（大鼠体表面积比值） =85mg/kg 安乐死药物与方法 吸入性药剂 非吸入性 (化学性）药剂 物理性方法 首选使用过量的化学性麻醉剂。科研所需无法使用 麻醉药时，使用物理性安乐死方法。 吸入性药剂 常用药物：乙醚、氮气、一氧化碳、二氧化碳等； 注意对人体有害，须在通风良好场所进行； 二氧化碳常用于啮齿类实验动物，兔子以上中大 型动物较不建议使用。吸入 40%二氧化碳很快达到 麻醉效果，长时间吸入则动物死亡。 非吸入性 (化学性）药剂 静

12、脉注射是最佳选择。腹腔注射需较高剂量且可 能使动物死亡时间延长及死前挣扎。 巴比妥盐及衍生物是首选药物。 深度麻醉中的动物可以快速静脉注射 KCl(2mmol/kg)来完成安乐死。 物理性方法 包括颈椎脱臼、放血、电击等； 颈椎脱臼法常用于体重低于 200克的啮齿类动物、禽类及 体重低于一公斤的仔兔； 实验需要无法使用化学性药物或二氧化碳时，可利用断头 台（啮齿类实验动物及仔兔）； 如需放血时，动物需麻醉后进行。 Definition: Transgenic Animal Animal in which a segment of DNA has been physically inserted

13、 into the genome. The genome of all cells of the organism contains the DNA segment. The DNA segment is present in the germ line so it can be transmitted to progeny as a Mendelian trait. 1. Test gene function 2. Provide models of specific diseases (progression of disease, alterations in other pathway

14、s related to disease, test therapies) 3. Determine function of genes in embryogenesis and in adult life 4. Drug validation Purposes/Applications Two General Classes: 1. Transgenic (overexpressing) 2. Knockout or targeted gene disruption Techniques: 1. Pronuclear transfers: Addition of new genetic ma

15、terial Microinjection of DNA into embryo 2. Homologous recombination between exogenous and genomic DNA (the specific replacement of a subset of genetic material with other genetic material) 3. Inducible/Conditional Knockout Transgenesis in Mice Retroviral Vector Transgenesis in Mice Microinjection T

16、ransgenesis in Mice Stem Cell Method 10%-90% egg survival after microinjection 20-60% of eggs surviving microinjection will develop to term 5-20% of animals born will carry the transgene A Few Facts about Transgenic Mouse Production Advantages: 1. Can use heterologous promoters to drive tissue or ce

17、ll-specific gene expression 2. Can produce animals that express the transgene at several different levels 3. Can cross species boundaries; no species specificity of the transgenes Concerns: 1. Transgene incorporates randomly into the genome 2. Multiple copies of the transgene incorporate 3. Possible

18、 to have more than one site of insertion 4. Transgene is subject to the influences of regulatory sequences flanking the site of insertion Considerations in making Tg mice Homologous recombination between exogenous and genomic DNA This is performed in pluripotent embryonic stem cells (ES cells) Knock

19、out or Targeted Gene Disruption Isolation of ES Cells Mate Chimera Mice to Generate Gene Knockout Mice Advantages: 1. Rather than random insertion of a transgene, defined, specific modifications are made in the endogenous gene and stably expressed in the germline of a mouse. 2. Genetic modifications

20、 are made directly to the endogenous gene. 3. Eliminate problems with abnormal regulation by flanking regulatory elements Concerns: 1. Phenotypic variation on different genetic backgrounds 2. Gene redundancy or compensatory mechanisms Considerations in Making Knockout Mice Cre/lox system Cre recombi

21、nase = gene splicing enzyme derived from bacteriophage P1 Cre binds to specific DNA sequence called loxP In bacteriophage, loxP is used as a landmark for Cre to assure that only one copy of the viral genome is present If Cre finds a 2nd loxP site (meaning more than one copy of gene), it splices out

22、the intervening DNA and the 2nd loxP site Inducible/Conditional Knockout Cre/Flp-mediated excision and inversion with mutated recombinase target sites A . C re o r F l p - me d i a te d Ex c i s i o n a d c b a db b C C a d C r e o r Fl p W i l d t y p e L o x P o r F R T W i l d t y p e L o x P o r

23、 F R T W i l d t y p e L o x P o r F R T W i l d t y p e L o x P o r F R T a d c b a db b C C a d C r e o r Fl p L E m u t a n t L o x P o r F R T R E mu t a n t L o x P o r F R T D o u b l e mu t a n t L o x P o r F R T W i l d t y p e L o x P o r F R T a a d d B B B C C C a d a a d d B B B C C C a

24、 d C r e or FlpC r e or Flp L E m u t a n t L o x P o r F R T R E mu t a n t L o x P o r F R T D o u b l e mu t a n t L o x P o r F R T W i l d t yp e L o x P o r F R T W i l d t yp e L o x P o r F R T W i l d t yp e L o x P o r F R T W i l d t yp e L o x P o r F R T W i l d t yp e L o x P o r F R T

25、 B . C re o r F l p - m e d i a te d f l i p A . C re o r F l p - me d i a te d Ex c i s i o n a d c b a db b C C a d C r e o r Fl p W i l d t y p e L o x P o r F R T W i l d t y p e L o x P o r F R T W i l d t y p e L o x P o r F R T W i l d t y p e L o x P o r F R T a d c b a db b C C a d C r e o

26、r Fl p L E m u t a n t L o x P o r F R T R E mu t a n t L o x P o r F R T D o u b l e mu t a n t L o x P o r F R T W i l d t y p e L o x P o r F R T a a d d B B B C C C a d a a d d B B B C C C a d C r e or FlpC r e or Flp L E m u t a n t L o x P o r F R T R E mu t a n t L o x P o r F R T D o u b l e mu t a n t L o x P o r F R T W i l d t yp e L o x P o r F R T W i l d t yp e L o x P o r F R T W i l d t yp e L o x P o r F R T W i l d t yp e L o x P o r F R T W i l d t yp e L o x P o r F R T B . C re o r F l p - m e d i a te d f l i p Conditional Knockout