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1、实验六实验六 伪狂犬抗体检测伪狂犬抗体检测（阻断（阻断ELISA)一、实验目的一、实验目的1.了解伪狂犬的抗体检测方法；了解伪狂犬的抗体检测方法；2.掌握掌握ELISA的原理和类型；的原理和类型；3.掌握阻断掌握阻断ELISA检测方法的操作程序。检测方法的操作程序。二、实验原理二、实验原理1.抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，并保持其免疫学活性；并保持其免疫学活性；2.抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性；而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性；3.酶
2、酶结结合合物物与与相相应应抗抗原原或或抗抗体体结结合合后后，可可根根据据加加入入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在。底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在。单抗单抗血清？血清？底物显色底物显色阻断阻断ELISA1.酶标板，酶标仪酶标板，酶标仪2.包被缓冲液：包被缓冲液：0.025M pH9.6碳酸盐缓冲液碳酸盐缓冲液3.猪伪狂犬病毒（猪伪狂犬病毒（PRV）抗原抗原4.样品稀释液：样品稀释液：pH7.4 PBS三、实验材料三、实验材料4.阴性对照阴性对照（EP管中，已稀释）管中，已稀释）5.阳性对照阳性对照（EP管中，已稀释）管中，已稀释）6.样品样品 待测猪血清待测猪血清（EP管中，已
3、稀释）管中，已稀释）7.HRP标记猪标记猪PRV单抗单抗 酶标单抗酶标单抗（EP管中，管中，已稀释）已稀释）8.洗涤液：含洗涤液：含0.05%Tween 20的的0.01M pH7.4 PBS（青瓶）（青瓶）常用酶及底物常用酶及底物常用酶常用酶底物底物加终止液前加终止液前颜色颜色加终止液后加终止液后颜色颜色碱性磷酸酶碱性磷酸酶（APAP）邻苯二胺邻苯二胺（OPDOPD）橙黄色橙黄色棕黄色棕黄色辣根过氧化物辣根过氧化物酶（酶（HRPHRP）四甲基联苯胺四甲基联苯胺（TMBTMB）蓝色蓝色蓝色蓝色9.底物缓冲液：底物缓冲液：pH5.0磷酸盐柠檬酸缓冲液磷酸盐柠檬酸缓冲液10.底物溶液：底物溶液：T
4、MB（四甲基联苯胺）（四甲基联苯胺），底物缓冲，底物缓冲液，液，30%H2O2，新鲜配制新鲜配制11.终止液终止液1.1.抗原的处理：抗原的处理：2.2.包被抗原：包被抗原：取酶标板，加入取酶标板，加入取酶标板，加入取酶标板，加入100L/100L/100L/100L/孔的抗原稀释液孔的抗原稀释液孔的抗原稀释液孔的抗原稀释液 4 4 4 4，18h18h18h18h取出包被好抗原的酶标板（取出包被好抗原的酶标板（取出包被好抗原的酶标板（取出包被好抗原的酶标板（4 4 4 4孔孔孔孔/组），甩干孔内液体组），甩干孔内液体组），甩干孔内液体组），甩干孔内液体以洗涤液（以洗涤液（200L/200L/
5、孔）洗涤孔）洗涤3 3次，次，3min/3min/次次四、实验方法四、实验方法3.3.加待测血清：加待测血清：标记各孔，加入相应液体标记各孔，加入相应液体100L/100L/孔孔1234阴阴性性待待测测阳阳性性待待测测4.4.加酶标单抗：加酶标单抗：3737，30min30min甩干孔内液体甩干孔内液体以洗涤液（以洗涤液（200L/200L/孔）洗涤孔）洗涤3 3次，次，3min/3min/次次各孔加入酶标单抗各孔加入酶标单抗100L/100L/孔孔3737，30min30min5.5.显色：显色：甩干孔内液体甩干孔内液体以洗涤液（以洗涤液（200L/200L/孔）洗涤孔）洗涤3 3次，次，3
6、min/3min/次次加入底物液加入底物液A A和和B B各一滴（约各一滴（约5050l l）避光显色避光显色10min10min，加终止液一滴，加终止液一滴6.6.观察结果观察结果1.取稀释好的被检血清取稀释好的被检血清2份和阴、阳性对照血清，每孔加入份和阴、阳性对照血清，每孔加入100l，置置37温育温育30分钟。分钟。2.洗板：甩掉板孔中的溶液，每孔加入稀释好的洗涤液洗板：甩掉板孔中的溶液，每孔加入稀释好的洗涤液200l，静置，静置3分钟倒掉，再在吸水纸上拍干，重复分钟倒掉，再在吸水纸上拍干，重复3次。次。3.每孔加酶标单抗每孔加酶标单抗100l，置，置37温育温育30分钟。分钟。4.洗
7、板：同步骤洗板：同步骤2。5.显色与终止：每孔先加底物显色与终止：每孔先加底物A液、再液、再B液各液各1滴滴(50l)，混匀，室温，混匀，室温（18-25）避光显色）避光显色10分钟后。分钟后。6.终止：每孔加终止液终止：每孔加终止液1滴滴(50l)（0.25%氢氟酸），终止反应。氢氟酸），终止反应。7.10分钟内测定结果。采用波长分钟内测定结果。采用波长630nm的酶标仪测定的酶标仪测定OD值。值。8.结果判定：试验成立的条件是：阴性对照孔平均结果判定：试验成立的条件是：阴性对照孔平均OD630值与阳性值与阳性对照孔平均对照孔平均OD630值之差值之差0.3。9.S=样品孔样品孔OD630值
8、，值，N=阴性对照孔阴性对照孔OD630值值如果如果S/N比值比值0.35，样品判定为，样品判定为PRV抗体阳性。抗体阳性。如果如果S/N比值比值0.4但但 0.35，样品重测。，样品重测。如果如果S/N比值比值 0.4，样品判定为，样品判定为PRV抗体阴性。抗体阴性。五、结果与分析五、结果与分析1.阴阳性对照样品的阴阳性对照样品的OD630?2.S/N?，被检血清是阴，被检血清是阴/阳性？阳性？3.结果与预期的不符，可能的原因是什么？结果与预期的不符，可能的原因是什么？预期结果预期结果l阳性：无色阳性：无色l阴性：蓝色阴性：蓝色1 2 3 4阳性阳性阳性阳性阴性阴性被检被检血清？血清？底物显
9、色底物显色被检被检？单抗单抗1.ELISA实验前血清样品尽量做到实验前血清样品尽量做到56灭活灭活30分钟。分钟。2.在在ELISA的整个操作过程中，洗涤是非常重要步骤，目的整个操作过程中，洗涤是非常重要步骤，目的在于防止重叠引起非特异性吸附，洗涤时尽可能除去的在于防止重叠引起非特异性吸附，洗涤时尽可能除去未结合的抗原及杂质，用力甩干。未结合的抗原及杂质，用力甩干。3.加入底物液后应室温避光，结果判断须在加入底物液后应室温避光，结果判断须在10分钟内。分钟内。4.实验中保持安定，不要随意走动、讨论不相关的事情。实验中保持安定，不要随意走动、讨论不相关的事情。六、注意事项六、注意事项显色显色显色
10、显色间接间接ELISA酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA)将已知的抗原或抗体吸附在固相载体将已知的抗原或抗体吸附在固相载体(聚苯聚苯乙烯微量反应板乙烯微量反应板)表面，使酶标记的抗原抗体反表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，根据加入底物的颜色反应应在固相表面进行，根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在。来判定是否有免疫反应的存在。间接法（间接法（Indirect ELISA）阻断法（阻断法（Block ELISA)双抗体夹心法（双抗体夹心法（Sandwich ELISA)竞争法（竞争法（Compet
11、itive ELISA)（1 1）间接法测定抗体）间接法测定抗体A.A.A.A.将将将将抗原抗原抗原抗原吸附于固相载体表面；吸附于固相载体表面；吸附于固相载体表面；吸附于固相载体表面；B.B.B.B.加抗体加抗体加抗体加抗体,形成抗原形成抗原形成抗原形成抗原-抗体复合物抗体复合物抗体复合物抗体复合物;C.C.C.C.加酶标抗体；加酶标抗体；加酶标抗体；加酶标抗体；D.D.D.D.加底物。测定底物的降解量抗体量。加底物。测定底物的降解量抗体量。加底物。测定底物的降解量抗体量。加底物。测定底物的降解量抗体量。（2 2）阻断法测定抗体）阻断法测定抗体A.A.A.A.将将将将抗原抗原抗原抗原吸附在固相
12、载体表面吸附在固相载体表面吸附在固相载体表面吸附在固相载体表面;B.B.B.B.先加待检血清（抗体）先加待检血清（抗体）先加待检血清（抗体）先加待检血清（抗体）,形成抗原形成抗原形成抗原形成抗原-抗体复合物抗体复合物抗体复合物抗体复合物;C.C.C.C.再加酶标单抗；再加酶标单抗；再加酶标单抗；再加酶标单抗；D.D.D.D.加底物。加底物。加底物。加底物。（3 3）双抗体夹心法测定抗原）双抗体夹心法测定抗原A.A.A.A.将将将将抗体抗体抗体抗体吸附于固相表面吸附于固相表面吸附于固相表面吸附于固相表面;B.B.B.B.加待检抗原，形成抗原加待检抗原，形成抗原加待检抗原，形成抗原加待检抗原，形成
13、抗原-抗体复合物抗体复合物抗体复合物抗体复合物;C.C.C.C.加酶标抗体加酶标抗体加酶标抗体加酶标抗体;E.E.E.E.加底物。底物的降解量抗原量。加底物。底物的降解量抗原量。加底物。底物的降解量抗原量。加底物。底物的降解量抗原量。（4 4）竞争法测定抗原）竞争法测定抗原A.A.A.A.抗体抗体抗体抗体吸附在固相载体表面吸附在固相载体表面吸附在固相载体表面吸附在固相载体表面;B.B.B.B.同同同同时时时时加加加加入入入入酶酶酶酶标标标标抗抗抗抗原原原原和和和和待待待待测测测测抗抗抗抗原原原原，竞竞竞竞争争争争结结结结合合合合抗抗抗抗体体体体；对对对对照照照照只只只只加加加加入酶标抗原；入酶标抗原；入酶标抗原；入酶标抗原；C.C.C.C.加底物。对照孔与样品孔底物降解量的差未知抗原量。加底物。对照孔与样品孔底物降解量的差未知抗原量。加底物。对照孔与样品孔底物降解量的差未知抗原量。加底物。对照孔与样品孔底物降解量的差未知抗原量。思考题思考题1.间接间接ELISA和阻断和阻断ELISA有什么异同？哪有什么异同？哪种方法要好一些，为什么种方法要好一些，为什么?2.伪狂犬的抗体检测方法有哪些？原理是什伪狂犬的抗体检测方法有哪些？原理是什么？么？
动物传染病学：实验六 伪狂犬抗体检测
