HPLC样品前处理技术课件

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1、 高效液相色谱样品前处理技术高效液相色谱样品前处理技术n在做样品之前首先要知道样品大致情况是纯品还在做样品之前首先要知道样品大致情况是纯品还是粗品，如果是粗品是哪一类的原料。是粗品，如果是粗品是哪一类的原料。n要了解待测组份的性质和化学结构，才能够为样要了解待测组份的性质和化学结构，才能够为样品的前处理和色谱条件的选择打基础。品的前处理和色谱条件的选择打基础。n上机分析之前上机分析之前 ，准备好样品、选择好色谱条件、，准备好样品、选择好色谱条件、保证仪器正常运行。保证仪器正常运行。n注：样品在上机分析之前一定要过滤注：样品在上机分析之前一定要过滤 流动相要过滤、脱气流动相要过滤、脱气HPLC样

2、品前处理技术课件n在复杂基体中低浓度有机化合物的分离和测定是在复杂基体中低浓度有机化合物的分离和测定是分析化学所面临的一个挑战虽然分析仪器的自分析化学所面临的一个挑战虽然分析仪器的自动化程度日益提高，但在发展分析方法的同时，动化程度日益提高，但在发展分析方法的同时，人们或多或少忽视了样品的预处理问题。人们或多或少忽视了样品的预处理问题。n然而在分析复杂样品，如生物样品、环境样品、然而在分析复杂样品，如生物样品、环境样品、植物样品等，为了获得比较可靠的鉴定结果植物样品等，为了获得比较可靠的鉴定结果,必须必须花费很多的人力和经费，并且由于前处理步骤多，花费很多的人力和经费，并且由于前处理步骤多，如

3、果前处理不当，往往会使全过程的回收率降低，如果前处理不当，往往会使全过程的回收率降低，会发生定性定量错误和色谱柱寿命缩短等问题会发生定性定量错误和色谱柱寿命缩短等问题因此，提高和掌握样品的前处理技术是完善检测因此，提高和掌握样品的前处理技术是完善检测全过程的重要环节。全过程的重要环节。n目前仍沿用溶剂提取、色谱分离或液目前仍沿用溶剂提取、色谱分离或液-液分配等纯液分配等纯化方法。化方法。HPLC样品前处理技术课件 样品预处理的内容繁多，如样品预处理的内容繁多，如n液体样品：液体样品：直接上机、稀释、富集、抽提、离心、直接上机、稀释、富集、抽提、离心、过滤后上过滤后上机机n固体样品：溶解、离心、

4、萃取固体样品：溶解、离心、萃取n生物样品（如，血液、尿液、动物组织及器官等生物样品（如，血液、尿液、动物组织及器官等样品）：预处理样品）：预处理 HPLC样品前处理技术课件一般说来，一般说来，样品预处理要达到的目标如下样品预处理要达到的目标如下：1 1去除基体中干扰样品分析的杂质，提高去除基体中干扰样品分析的杂质，提高分析精度和分离效果；分析精度和分离效果；2 2提高被测定化合物检测灵敏度；提高被测定化合物检测灵敏度；3 3提高样品与流动相的兼容性，从而改善提高样品与流动相的兼容性，从而改善 定性定量分析的重复性定性定量分析的重复性HPLC样品前处理技术课件n 高效液相色谱分析样品时没有统一的

5、前处高效液相色谱分析样品时没有统一的前处理方法。必须根据样品的种类和待测项目决理方法。必须根据样品的种类和待测项目决定前处理方案，但原则上仍应考虑几下定前处理方案，但原则上仍应考虑几下操作操作环节环节：n如取样、试样的调制、提取、纯化、浓缩等如取样、试样的调制、提取、纯化、浓缩等步骤，步骤，n至于各种具体样品的前处理可以进一步参考至于各种具体样品的前处理可以进一步参考有关资料。有关资料。HPLC样品前处理技术课件 （一）取样与调制一）取样与调制 固体块状样品固体块状样品的取样与调制的取样与调制n为了得到较为可靠的结果，取样的代表性极为重要。为了得到较为可靠的结果，取样的代表性极为重要。一般取样

6、操作要点可概括为：一般取样操作要点可概括为：n第一步随机抽样，抽样量要根据样品数量而定，第一步随机抽样，抽样量要根据样品数量而定，n第二步再按四分法将试样缩分到所需的量，第二步再按四分法将试样缩分到所需的量，n第三步再取所需的量。样品得到后必须进行粉碎和第三步再取所需的量。样品得到后必须进行粉碎和混匀，混匀，n小量样品可以使用研钵，较多的试样可使用电动小量样品可以使用研钵，较多的试样可使用电动 粉碎机粉碎。粉碎后，应通过粉碎机粉碎。粉碎后，应通过2020一一3030目筛孔用筛过目筛孔用筛过筛，混合均匀，制得试样。筛，混合均匀，制得试样。HPLC样品前处理技术课件n当试样含水分较多而较难粉碎时，

7、特别是待分析的成分不会因干燥而发生变当试样含水分较多而较难粉碎时，特别是待分析的成分不会因干燥而发生变化时，需进行予干燥。一般将已粉碎的试样置于化时，需进行予干燥。一般将已粉碎的试样置于6060烘箱中烘烘箱中烘1 12 2小时，称小时，称取干燥前后的重量，分析维生素类的物质时通常不进行予干燥。取干燥前后的重量，分析维生素类的物质时通常不进行予干燥。n当待测成分会因干燥而分解时，只能将原样进行研磨，或加适量溶液研磨，当待测成分会因干燥而分解时，只能将原样进行研磨，或加适量溶液研磨，使其成为均匀的分析试样。水果等样品可使用研钵。使其成为均匀的分析试样。水果等样品可使用研钵。n鱼肉等样先用小刀切成小

8、块后，用绞肉机绞碎。鱼肉等样先用小刀切成小块后，用绞肉机绞碎。n水果糖等样，能简单溶于水或适当的溶剂，可制成溶液，搅拌匀。水果糖等样，能简单溶于水或适当的溶剂，可制成溶液，搅拌匀。n油脂类也能一次性溶解，使其成为溶液、混匀。油脂类也能一次性溶解，使其成为溶液、混匀。n牛奶等，因比重不同，溶液上下不均匀，这时可将玻璃管插到底部，在所有牛奶等，因比重不同，溶液上下不均匀，这时可将玻璃管插到底部，在所有的层次取样，或者用搅拌棒搅匀，取其搅匀的样品。的层次取样，或者用搅拌棒搅匀，取其搅匀的样品。n啤酒、汽水等含碳酸的饮料，在啤酒、汽水等含碳酸的饮料，在2020一一2525度加热，完全逐出碳酸后再进行分

9、析。度加热，完全逐出碳酸后再进行分析。n贝壳类除去壳，仅将贝肉磨碎。贝壳类除去壳，仅将贝肉磨碎。n干鱼可直接粉碎制备试样。干鱼可直接粉碎制备试样。HPLC样品前处理技术课件 （二）提取方法（二）提取方法 提取方法：提取方法：n液液-液萃取液萃取n液液-固萃取固萃取n超声波萃取超声波萃取n微波萃取微波萃取n膜技术：微渗透膜技术：微渗透 超滤膜技术超滤膜技术HPLC样品前处理技术课件n从技术角度而言植物及食品样品分析最为困难的是：从技术角度而言植物及食品样品分析最为困难的是：待测成分从样品基体中将其分离。待测成分从样品基体中将其分离。n目前，常用的提取分离方法仍采用溶剂提取法目前，常用的提取分离方

10、法仍采用溶剂提取法n选择提取溶剂时，应考虑到：选择提取溶剂时，应考虑到：1 1、提取溶剂是否会与待测成分发生反应；、提取溶剂是否会与待测成分发生反应；2 2、欲分析物质的极性；、欲分析物质的极性；3 3、欲分析物质在不同溶剂中的溶解性；、欲分析物质在不同溶剂中的溶解性；4 4、欲提取样品的类型、欲提取样品的类型(含水多、含油多、干材等）；含水多、含油多、干材等）；5 5、溶剂的毒性；、溶剂的毒性；6 6、溶剂的挥发性、溶剂的挥发性 7 7、溶剂的纯度；、溶剂的纯度；8 8、溶剂的价格等。、溶剂的价格等。HPLC样品前处理技术课件n一般亲水性溶剂应用于提取亲水性化物，一般亲水性溶剂应用于提取亲水

11、性化物，n而疏水性溶剂最适宜提取脂溶性和油溶性化台而疏水性溶剂最适宜提取脂溶性和油溶性化台物。物。n欲欲分析物质在溶剂中的溶解度分析物质在溶剂中的溶解度是选择最适宜溶是选择最适宜溶剂时的另一个重要因素。剂时的另一个重要因素。n不同类型的样品需要不同的溶剂。一般用水溶不同类型的样品需要不同的溶剂。一般用水溶性溶剂提取含水量高的样品。性溶剂提取含水量高的样品。n而用乙腈提取脂溶性或油溶性样品。而用乙腈提取脂溶性或油溶性样品。n氯仿和二氯甲烷是提取干性材料的最适宜溶剂。氯仿和二氯甲烷是提取干性材料的最适宜溶剂。n如果有多种溶剂都适用于提取，那么应该首先如果有多种溶剂都适用于提取，那么应该首先选用毒性

12、最小的溶剂以保护分析人员的身体健选用毒性最小的溶剂以保护分析人员的身体健康。康。HPLC样品前处理技术课件n在控制监测中，当被测成份和样品类型已知时，在控制监测中，当被测成份和样品类型已知时，理论上可选择最合适的溶剂。理论上可选择最合适的溶剂。n根据样品类型和被测成份种类使用不同方法进根据样品类型和被测成份种类使用不同方法进行提取。行提取。n在实际工作中最广泛使用的提取溶剂有：在实际工作中最广泛使用的提取溶剂有：二氯甲烷、氯仿、丙酮、乙腈、乙酸乙脂、二氯甲烷、氯仿、丙酮、乙腈、乙酸乙脂、苯、乙醇、甲醇、石油醚、已烷等或它们苯、乙醇、甲醇、石油醚、已烷等或它们 的混合剂。的混合剂。n在此基础上可

13、以得知有广泛适用性的使用方案在此基础上可以得知有广泛适用性的使用方案(溶剂样品化合物基体溶剂样品化合物基体)HPLC样品前处理技术课件1 1、液、液液分配法提取样品液分配法提取样品n。n采用液采用液液分配法可把不同溶解度的化合物液分配法可把不同溶解度的化合物分开。正确选择萃取溶剂即可把被测成份萃分开。正确选择萃取溶剂即可把被测成份萃取出来，使其与大多数共萃物分开，取出来，使其与大多数共萃物分开，n色谱分离情况与样品大小有关。随着样品大色谱分离情况与样品大小有关。随着样品大小增加，分离情况变差，小增加，分离情况变差，n因此样品大小无限度地增加会使分配系数和因此样品大小无限度地增加会使分配系数和分

14、离效率降低。分离效率降低。HPLC样品前处理技术课件n液液-液萃取最早被用于样品的预处理，这一方法可液萃取最早被用于样品的预处理，这一方法可把有机化合物直接萃取到与水不相溶的有机相中，把有机化合物直接萃取到与水不相溶的有机相中，在一定温度下，溶质在两种互不相溶的溶剂分配时，在一定温度下，溶质在两种互不相溶的溶剂分配时，平衡浓度之比为一常数，这一常数称为分配常数。平衡浓度之比为一常数，这一常数称为分配常数。n只有中性分子才能被萃取，两相中溶质总浓度之比只有中性分子才能被萃取，两相中溶质总浓度之比为分配系数，溶质在两相中的分配系数与选用的萃为分配系数，溶质在两相中的分配系数与选用的萃取溶剂、水相的

15、取溶剂、水相的pHpH和有机溶剂与水相的体积比值相和有机溶剂与水相的体积比值相关。关。n液液-液萃取尽可能选用溶质有较大溶解度的有机溶液萃取尽可能选用溶质有较大溶解度的有机溶剂，如果溶质的萃取回收率较低，可通过连续多次剂，如果溶质的萃取回收率较低，可通过连续多次萃取提高回收率，通常采用过量的有机溶剂来萃取，萃取提高回收率，通常采用过量的有机溶剂来萃取，以节省时间。以节省时间。HPLC样品前处理技术课件1.11.1、萃取溶剂的选择、萃取溶剂的选择n被测化合物的相对疏水性将决定萃取溶剂的选择，用于液被测化合物的相对疏水性将决定萃取溶剂的选择，用于液-液萃取的有机溶剂必须满足：（液萃取的有机溶剂必须

16、满足：（1 1）沸点低，以便可以在）沸点低，以便可以在完成液完成液-液萃取后很快可将有机溶剂挥发；（液萃取后很快可将有机溶剂挥发；（2 2）溶剂的粘）溶剂的粘度低，以使与样品基本相混合，度低，以使与样品基本相混合，n下表是按溶剂极性排序的一些常用液下表是按溶剂极性排序的一些常用液-液萃取溶剂，液萃取溶剂，n表中有机溶剂在水中的溶解度是一个重要的因素，溶剂在表中有机溶剂在水中的溶解度是一个重要的因素，溶剂在水中的溶解度对萃取液中的共萃取干扰物质的含量有重要水中的溶解度对萃取液中的共萃取干扰物质的含量有重要的影响，一般来说，萃取的有机溶剂极性越小，萃取的选的影响，一般来说，萃取的有机溶剂极性越小，

17、萃取的选择性越好，择性越好，n因此，选择液因此，选择液-液萃取的有机溶剂在能溶解样品的前提下，液萃取的有机溶剂在能溶解样品的前提下，极性应尽可能低。极性应尽可能低。HPLC样品前处理技术课件表：一些常用液表：一些常用液-液萃取有机溶剂的物理化学性质液萃取有机溶剂的物理化学性质溶溶剂剂沸点（沸点（）溶溶剂剂极性极性（）在水中的溶解度在水中的溶解度（%）正己正己烷烷690001环环己己烷烷810001氯氯仿仿6144082二二氯氯甲甲烷烷4034130乙乙醚醚35604乙酸乙乙酸乙酯酯7743808HPLC样品前处理技术课件1.2 pH1.2 pH值的控制值的控制 液液-液萃取所采用的液萃取所采用

18、的pHpH值应使被萃取的样品的萃取的有机溶值应使被萃取的样品的萃取的有机溶剂（如乙酸乙酯）具有良好的稳定性，为了使萃取过程有良剂（如乙酸乙酯）具有良好的稳定性，为了使萃取过程有良好的回收率，应当调节水相的好的回收率，应当调节水相的pHpH使溶质以中性状态存在，如使溶质以中性状态存在，如有机酸为例，其在水相和有机相的分配过程存在以下平衡：有机酸为例，其在水相和有机相的分配过程存在以下平衡：HL HL0 HL HL0 H H+L+L-HL HL 有实验表明，一元羧酸在水相的有实验表明，一元羧酸在水相的pHpH值低于值低于3.03.0时可以很好地时可以很好地被萃取到有机相中，而当被萃取到有机相中，而

19、当pHpH值大于值大于5.05.0时，则主要溶解在水时，则主要溶解在水相中，很难被有机相萃取，利用相中，很难被有机相萃取，利用pHpH值对分配系数的影响，可值对分配系数的影响，可以将有机酸或有机碱从水相萃取到有机相中，反之可以把有以将有机酸或有机碱从水相萃取到有机相中，反之可以把有机相中的弱酸、弱碱萃取到水相中，机相中的弱酸、弱碱萃取到水相中，HPLC样品前处理技术课件1.31.3液液-液萃取其他操作因素的控制液萃取其他操作因素的控制n液液-液萃取并不能对所有的化合物。液萃取并不能对所有的化合物。n强极性化合物取得良好的萃取，如有机强极性化合物取得良好的萃取，如有机酸或有机碱，可以在水相中加入

20、适当的酸或有机碱，可以在水相中加入适当的反电荷离子对试剂，达到液反电荷离子对试剂，达到液-液萃取强液萃取强有机酸或有机碱的目的，又如金属离子，有机酸或有机碱的目的，又如金属离子，通过在水相中加入鳌和剂与金属离子形通过在水相中加入鳌和剂与金属离子形成疏水性的络合物达到萃取金属离子的成疏水性的络合物达到萃取金属离子的效果。效果。HPLC样品前处理技术课件（二）液（二）液-固萃取固萃取n 液液-液萃取有许多局限，如：液萃取有许多局限，如：n需要大量互不相溶的溶剂；需要大量互不相溶的溶剂；n样品处理步骤复杂；样品处理步骤复杂；n样品回收率和重复性不理想；样品回收率和重复性不理想；n处理过程中乳状液的生

21、成；处理过程中乳状液的生成；n溶剂蒸发时，样品降解所至的样品损失。溶剂蒸发时，样品降解所至的样品损失。HPLC样品前处理技术课件n液液-固萃取方法采取高效、高选择性的固定相，固萃取方法采取高效、高选择性的固定相，n液液-固萃取主要用于样品分析前净化和或富集固萃取主要用于样品分析前净化和或富集，n净化操作是样品分析中最重要的步骤之一。净化操作是样品分析中最重要的步骤之一。n因为在提取操作之后，提取物中既有被测因为在提取操作之后，提取物中既有被测 成份又有别的干扰物或共萃物。这些物质成份又有别的干扰物或共萃物。这些物质 可由下列化合物组成：探发性物质、胺类、可由下列化合物组成：探发性物质、胺类、酚

22、类、有机酸类糖类、油脂、叶绿素和其酚类、有机酸类糖类、油脂、叶绿素和其 他有色物质等。他有色物质等。HPLC样品前处理技术课件净化方法中的一些问题净化方法中的一些问题n提取液在净化前，必须对待测化合物的一些提取液在净化前，必须对待测化合物的一些重要的物理性质有所了解，如在有机溶剂和重要的物理性质有所了解，如在有机溶剂和水中的溶解性；酸性；稳定性；蒸气压；熔水中的溶解性；酸性；稳定性；蒸气压；熔点，沸点，极性。点，沸点，极性。nSEPSEPPAKPAK预处理柱预处理柱-应用于样品的纯化及痕应用于样品的纯化及痕量浓缩等方面。量浓缩等方面。HPLC样品前处理技术课件HPLC样品前处理技术课件HPLC

23、样品前处理技术课件固相萃取的影响因素固相萃取的影响因素n固相萃取一般有四个基本步骤：固相萃取一般有四个基本步骤：固定相活化；样品上柱；淋洗；分析物洗脱。固定相活化；样品上柱；淋洗；分析物洗脱。n活化的目的活化的目的是创造一个与样品溶剂相溶的环是创造一个与样品溶剂相溶的环境并除去柱内所有的杂质，通常需要两种溶境并除去柱内所有的杂质，通常需要两种溶剂来完成，第一个溶剂（初溶剂）用于净化剂来完成，第一个溶剂（初溶剂）用于净化固定相，第二个溶剂（终溶剂）用于建立一固定相，第二个溶剂（终溶剂）用于建立一个合适的固定相环境使样品分析物得到适当个合适的固定相环境使样品分析物得到适当的保留。的保留。n每一活化

24、溶剂用量约每一活化溶剂用量约1 12ml/100mg2ml/100mg固定相。固定相。HPLC样品前处理技术课件n除去杂质的最好方法除去杂质的最好方法是用初溶剂洗柱，初溶剂应是用初溶剂洗柱，初溶剂应该与洗脱溶剂一样强或强与洗脱溶剂，这样就可该与洗脱溶剂一样强或强与洗脱溶剂，这样就可以除去所有可能与分析物一起洗出的物质。终溶以除去所有可能与分析物一起洗出的物质。终溶剂不应强与样品溶剂，若使用太强的溶剂，将降剂不应强与样品溶剂，若使用太强的溶剂，将降低回收率，通常采用的终溶剂要比样品溶液弱。低回收率，通常采用的终溶剂要比样品溶液弱。理想的终溶剂应该与样品溶剂性质相似，例如，理想的终溶剂应该与样品溶

25、剂性质相似，例如，一个水样被一个水样被HCIHCI调节到调节到pH2pH2，终溶剂（水）也应用，终溶剂（水）也应用HCIHCI调节到调节到pH2pH2。n值得注意的是，在活化过程中和结束时，固定相值得注意的是，在活化过程中和结束时，固定相都不能抽干，因为这样可导致填料床出现裂缝，都不能抽干，因为这样可导致填料床出现裂缝，使回收率降低、重复性差，样品也没有得到应有使回收率降低、重复性差，样品也没有得到应有的净化，如果在活化步骤中出现干裂，所有的活的净化，如果在活化步骤中出现干裂，所有的活化步骤都得重复。化步骤都得重复。HPLC样品前处理技术课件淋洗淋洗n分析物得到保留后，通常需要淋洗固定相以洗分

26、析物得到保留后，通常需要淋洗固定相以洗掉不需要的样品组分掉不需要的样品组分;n淋洗溶剂的洗脱强度是略强于或等于上样溶剂，淋洗溶剂的洗脱强度是略强于或等于上样溶剂，淋洗溶剂必须尽量地弱，以洗掉多的干扰组分，淋洗溶剂必须尽量地弱，以洗掉多的干扰组分，但不能强到可以把所有分析物都洗掉的程度但不能强到可以把所有分析物都洗掉的程度;n溶剂的体积为溶剂的体积为0.5-0.8mL/100mg0.5-0.8mL/100mg固定相，固定相，n淋洗步骤也能确保粘壁在样品都进入固定相。淋洗步骤也能确保粘壁在样品都进入固定相。HPLC样品前处理技术课件 洗脱洗脱n淋洗后再将分析物从固定相上洗脱下来。洗脱溶剂的体积为淋

27、洗后再将分析物从固定相上洗脱下来。洗脱溶剂的体积为0.5-0.8mL/100mg0.5-0.8mL/100mg固定相，溶剂必须认真选择。溶剂太强，一固定相，溶剂必须认真选择。溶剂太强，一些不要的组分将被洗出来，溶剂太弱，就需要更多的洗脱液。些不要的组分将被洗出来，溶剂太弱，就需要更多的洗脱液。n在溶剂选择上还有几点值得注意，有时在上样、淋洗和洗脱时在溶剂选择上还有几点值得注意，有时在上样、淋洗和洗脱时一个溶剂太强，另一个溶剂太弱，可以把两者混合，通过改变一个溶剂太强，另一个溶剂太弱，可以把两者混合，通过改变它们的比例来满足要求。它们的比例来满足要求。n另一值得注意的问题是溶剂的互溶性，后一种流

28、过柱床的溶剂另一值得注意的问题是溶剂的互溶性，后一种流过柱床的溶剂必须与前一溶剂互溶。必须与前一溶剂互溶。n有时候固体样品必须用一个很强的溶剂萃取，这样的萃取液是有时候固体样品必须用一个很强的溶剂萃取，这样的萃取液是不能直接上样，所以萃取液要用一个弱溶剂稀释以得到一个合不能直接上样，所以萃取液要用一个弱溶剂稀释以得到一个合适的溶剂强度进行上样，例如，一个土壤样品，采用适的溶剂强度进行上样，例如，一个土壤样品，采用50%50%的甲的甲醇萃取，得到醇萃取，得到2 mL 2 mL 萃取液，用萃取液，用8mL 8mL 水稀释，得到水稀释，得到10%10%的甲醇溶的甲醇溶液，这样就可以直接上反相固相萃取

29、柱而不出现穿漏的现象。液，这样就可以直接上反相固相萃取柱而不出现穿漏的现象。HPLC样品前处理技术课件浓缩浓缩n为了提高被测物在溶液中的浓度，提高检出率，为了提高被测物在溶液中的浓度，提高检出率，提取液经纯化以后均进行蒸发浓缩。提取液经纯化以后均进行蒸发浓缩。n目前最常用的浓缩方法：把经过纯化后的溶液转目前最常用的浓缩方法：把经过纯化后的溶液转移至园底烧瓶内，用旋转蒸发器在一定温度的水移至园底烧瓶内，用旋转蒸发器在一定温度的水浴中减压浓缩至一定量，经每分钟浴中减压浓缩至一定量，经每分钟50005000转的离心转的离心机离心机离心5 5分钟，取上清液液用于液相分析，也可用分钟，取上清液液用于液相分析，也可用0.45m0.45m滤膜过滤，滤液即可用于分析。滤膜过滤，滤液即可用于分析。n柱层析法除了纯化样品的作用外，尚可将被测物柱层析法除了纯化样品的作用外，尚可将被测物吸附浓缩。吸附浓缩。HPLC样品前处理技术课件建立高效液相色谱分析方法的一般步骤建立高效液相色谱分析方法的一般步骤HPLC样品前处理技术课件n HPLC样品前处理技术课件食品中多环芳烃HPLC样品前处理技术课件