生化综合实验

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1、酵母蔗糖酶的提取及其性质的研究一、蔗糖酶的制备1、提取称取14.997g干酵母粉于250ml小烧杯中，少量多次地加入50ml蒸馏水，搅拌均匀。 成糊状后加入1.499g乙酸钠、25ml乙酸乙酯，搅匀。再于35C恒温水浴中搅拌30min,然 后补加30ml蒸馏水，搅匀，盖好，于35C恒温过夜。之后，1000r/min离心10min,抽取 酯层后再次离心，得到无细胞提取液。用1M HCl将其PH调至5.0，即可得到级分I。（取 出 3ml 于冰箱中保存）2、热处理（1）盛有粗级分I的离心管放入50C水浴中保温30min，在保温过程中不断轻摇离 心管。（2）取出离心管，于冰浴中迅速冷却，用4C, 1

2、000r/min离心10min。（3）上清液即为热级分II。（取出3ml于冰箱中保存）3、乙醇沉淀将热级分II转入小烧杯中，放入冰浴，逐滴加入等体积预冷的95%乙醇，同时轻轻搅拌（此 过程共需30 min）。然后在冰浴中静置10 min，以沉淀完全。然后4C, 1000r/min离心10min。 倾去上清，并滴干。将沉淀保存于离心管中，冷冻保存，此即级分III。二、蔗糖酶的纯化将3ml级分III加入洗脱柱中进行梯度洗脱。及洗脱峰图如下：离子交换吸附梯度洗脱曲线洗脱份数三、蔗糖酶各级分活性及蛋白质含量的测定（一）还原糖含量测定1、各级分稀释倍数的确定级分I：取50p l稀释至1.5ml （30倍

3、）级分II：取50p l稀释至1.5ml （30倍）级分III：取50p l稀释至15ml （300倍） 取20p l稀释至2ml （100倍）级分I级分II级分III酶液(ml)0.60.30.20.60.30.20.6(100 倍)0.6(300 倍)0.3(300 倍)0.2(300 倍)H2O(ml)0.00.30.40.00.30.40.00.00.30.4PH5.0乙酸(ml)0.20.20.20.20.20.20.20.20.20.2蔗糖(0.2M)(ml)0.20.20.20.20.20.20.20.20.20.260C反应10min，再加1 ml 0.4 M NaOH终止反应

4、，然后加2 mlDNS沸水浴5 min。之后流水冷却，并定容到25 ml，测定A540吸光度0.2200.1380.0840.2180.114).0560.1840.0770.0370.012由以上数据可知，在测定各级分还原糖含量时，级分I和级分II稀释30倍，级分III稀 释 100 倍。2、生成还原糖的大批量测定级分I级分II级分II管号12345678910111213酶液(ml)0.6/0.60.60.60.60.60.60.60.60.6/H2O(ml)/0.6/10.8PH5.0乙酸0.20.20.20.20.20.20.20.20.20.20.2/Glu(4mM)/0.20.4M

5、NaOH1/蔗糖(0.2M)0.20.20.20.20.20.20.20.20.20.20.2/6 0C反应10min，再加1 ml 0.4 M NaOH终止反应，然后加2 mlDNS沸水浴5 min。之后流水冷却，并定容到25 ml，测定A540。吸光度0.001-0.0070.3220.3320.3240.1850.1860.1850.145 (舍去)0.1920.1880.05处理后的吸光度0.3060.3160.3080.1690.170.1690.1760.172对应的Glu含量(Mmol)9.119.409.175.035.065.035.245.12E45.547.045.825

6、.125.325.187.385.3平均E46.125.286.3Units/m 1(原始组分)0.00043350.00079370.0002317在上述表格中，Glu含量是由标准曲线求得的，E=Glu含量*稀释倍数/ (10 min*0.6 ml)Units=0.6 ml/Glu平均含量/2/10min/稀释倍数由洗脱峰可知，第二个和第三个峰最有可能是目标蛋白(第一个峰一般情况下是杂蛋白)。由此对第二个和第三个峰进行活力测定。第二个峰第三个峰管号12345酶液(ml)/0.60.60.60.6H2O(ml)1.0/PH5.0乙酸/0.20.20.20.2蔗糖(0.2M)/0.20.20.2

7、0.260C反应10min，再加1 ml 0.4 M NaOH终止反应，然后加2 mlDNS沸水浴5 min。之后流水冷却,吸光度Glu 含量（|J mol）E，平均EUnits/m 1（原始组分）并定容到25 ml,测定A5代-0.011-0.012|0.013/0.387/0.064480.0120.3570.059520.062000.04032备注：由测定数据可知,第二个峰不是目标蛋白,第三个峰为目标蛋白。（二）蛋白质含量测定1、各级分稀释倍数的确定1、标准曲线的制作管号123456789蛋白标准液（ml）0.00.10.20.30.40.50.60.81.0HO(ml)21.00.9

8、0.80.70.60.50.40.20.0考马斯亮蓝（ml）555555555蛋白质含量（p g）020406080100120160200A595100.0930.1640.3220.4140.4600.5880.7360.948蛋白质标准曲线050100150200250蛋白质含量（卩g）2、各级分稀释倍数的确定级分I级分II级分III稀释倍数48124812102030蛋白溶液（ml）0.050.050.050.050.050.050.20.20.2HO(ml)0.950.950.950.950.950.950.80.80.8考马斯亮蓝（ml）555555555吸光度0.1620.103

9、0.1340.2160.0860.1690.1550.0920.124由以上数据可知，级分I和级分II不需稀释，级分III需稀释5倍。2、蛋白质含量的大批量测定级分I级分II级分III峰I峰II蛋白溶液（ml）0.050.050.050.050.05H0(ml)20.950.950.950.950.95考马斯亮蓝（ml）55555A595 (1)0.3000.2090.0890.0480.075A595 (2)0.3260.2150.0830.0480.089A0.3700.249/0.081平均a5950.3320.2240.0860.0480.082蛋白质含量（p g）69.1746.74

10、17.9210.0017.01蛋白质浓度（mg/ml）1.3830.93471.7920.20000.3403三）酶的纯化表级分IIIIIIW记录体积（ml）5053505蛋白质（mg/ml）1.3830.93471.7920.3403总蛋白（mg）69.1549.539189.61.7015Units (ml)0.00043350.00079370.0002320.04032总 Units1.0842.1031.9310.3360比活（Units/mg）0.015670.042460.021550.1975纯化倍数12.71.412.6回收率（）100四、分离产物的电泳检测（见下页）五、反应

11、时间对产物浓度的影响反应时间（min）0134812203040吸光度0-0.004-0.008-0.004-0.004-0.0030.0140.0330.046还原糖含量（p mol）0-0.119-0.238-0.119-0.119-0.08930.416670.9821.369反应时间对产物浓度的影响)nm w量含糖原还反应时间（min）理论上，随着反应时间的延长，生成的还原糖含量越高，曲线斜率较大，当反应到达某一数值后，随着反应时间的延长，生成还原糖的含量基本不变，曲线基本上与横轴平行。但该曲线并不符合理论曲线，分析其原因，制备最初酶液时，稀释倍数太大，浓度太小，导致 其酶学性质变化不

12、明显。六、PH值对蔗糖酶活性的影响PH值3.54.04.55.05.56.0吸光度0.0400.0700.1010.1080.0830.030还原糖含量（p mol）1.1902.0833.0063.2142.4700.8929PH值对蔗糖酶活性的影响lom彳量含糖原还3.5003.0002.5002.0001.5001.0000.5000.000PH值由上图可知，随着PH值的升高，酶的活力不断增强。当PH值升高到某一数值后，随 着PH值的升高，酶活力逐渐下降（事实上，PH值升高到某一数值后，蔗糖酶就会失活）。 而且，由图表还可推断出，蔗糖酶的最适PH值为5.0左右。七、温度对酶活性的影响和反

13、应活化能的测定温度（C）4050607080吸光度0.0490.0760.1110.0380.019还原糖含量（p mol）1.4582.2623.3041.1310.5655酶活性(p mol/ min)0.14580.22620.33040.11310.05655温度对酶活性的影响0.35000.30000.2500比性活酶0.20000.15000.10000.05000.0000温度（C）由上图可知，随着温度的升高，酶活性逐渐增强，当温度升高到某一数值后，酶活性随着温度的升高而降低（事实上，温度上升到某一数值后，酶已失活）。该酶的最适温度在60C 左右。八、底物浓度对催化反应速度的影响

14、及米氏常数K和最大反应速度V的测定11|m1max1管号12m134max156780.5M 蔗糖 1)02030406080100200底物浓度（mol/1）0.00250.003750.0050.00750.010.01250.025l/S(1/mo1)400266.7200133.31008040HO 1)2600580570560540520500400PH5.0buffer(1)200200200200200200200200蔗糖酶（U 1）20020020020020020020020060 C酶促反应10minO.4MNaOH(m1)11111111DNS(ml)22222222

15、100C反应5min后，流水冷却，定容至25mlA54000.011（舍 去）0.0090.0150.0220.0270.0360.044还原糖含量（u g）00.26790.44640.65480.80361.0711.310反应速度（卩 g/min）0.026790.044640.065480.080360.10710.1310l/V(min/u g)37.3322.4015.2712.449.3337.636LineweaverBurk图由上图可知，横截距为1.926，由-1/K =1.926可求得，K =-0.5193mol/L。理论上，直mm 线的横截距应为负值，纵截距应为正值。该数

16、据明显为错误数据。但计算方法无误。导致错 误的原因，很可能是原酶液稀释倍数太高，致使最后的计算结果发生错误。 九、尿素对蔗糖酶的抑制作用管号123456780.5M 蔗糖(p l)02030406080100200底物浓度(mol/l)00.00250.003750.0050.00750.010.01250.025l/S(l/mol)400266.7200133.31008040蔗糖酶(p l)200200200200200200200200PH5.0buffer(p l)200200200200200200200200HO(p l)c1600580570560540520500400酶促反应

17、60C酶促反应10min0.4MNa0H(ml)11111111DNS(ml)22222222100C反应5min后，流水冷却，定容至25ml脲为0时A“0.0210.0310.0390.0460.0610.0630.081还原糖含量(p g)0.62500.92261.1611.3691.8151.8752.411反应速度(p g/min)0.062500.092260.11610.13690.18150.18750.2411l/V(min/p g)16.0010.848.6157.3045.5085.3334.148脲为100时A-0.0020.0160.0140.0350.0410.05

18、00.0610.070还原糖含量(p g)-0.059520.47620.41671.0421.2201.4881.8152.083反应速度(p g/min)-0.0059520.047620.041670.10420.12200.14880.18150.20831/V(min/p g)-16821/9.68.1956.725.5084.8脲为200时A-0.0010.0110.0200.0290.0400.0410.0300.061还原糖含量(p g)-0.029760.32740.59520.86311.1901.2200.89291.815反应速度(p g/min)-0.0029760.

19、032740.059520.086310.11900.12200.089290.18151/V(min/p g)-33630.5516.811.598.48.2011.25.508脲为300时A-0.0020.0160.0290.0260.0430.0520.0490.064还原糖含量(p g)-0.059520.47620.86310.77381.2801.5481.4581.905反应速度(p g/min)-0.0059520.047620.086310.077380.12800.15480.14580.19051/V(min/p g)-1682111.5912.927.8146.4626.8575.25LineweaverBurk图35.0030.0025.0020.0015.0010.005.00-300-20.00 0-10.00-15.00100200300400500l/S(l/mol)由上图可知，四条直线的纵截距大致相等，由此可推断，脲应为竞争性抑制剂，它和底 物竞争与酶的结合。当脲与酶结合后，就妨碍了底物与酶的结合，减少了酶的作用机会，因 而降低了酶的活力。