细胞程序性死亡与细胞衰老课件

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1、第十三章第十三章 程序性细胞死亡与细胞衰老程序性细胞死亡与细胞衰老1细胞程序性死亡与细胞衰老课件第一节第一节 程序性细胞死亡程序性细胞死亡一个主动的有基因决定的自动结束生命的过程。由于受到严格的由遗传机制决定的程序性调控，所以常常被称为细胞程序性死亡（programmed cell death,PCD）2细胞程序性死亡与细胞衰老课件机体结构机体结构细胞增殖细胞增殖细胞分化细胞分化细胞凋亡细胞凋亡细胞信号转导细胞信号转导染色体染色体（DNADNA与蛋白质的相互作用）与蛋白质的相互作用）衰老衰老3细胞程序性死亡与细胞衰老课件一.动物细胞的程序性死亡三种方式:凋亡坏死自噬(一)细胞凋亡概念:受基因控

2、制的主动的结束生命的过程,是一自然的生理过程.形态学特征:凋亡的起始:特化结构消失（微绒毛），细胞间接触消失，但质膜依然完整，有选择透性，线粒体大而完整，核糖体与内质网脱落，内质网腔膨大，并逐渐与质膜融合，染色质固缩化，形成新月形帽状结构，沿核膜分布4细胞程序性死亡与细胞衰老课件凋亡小体的形成：染色质断裂成大小不等的片段，与某些细胞器（线粒体）聚集在一起，被反折的质膜包围，形成凋亡小体，从外观上看，细胞表面发泡，产生了许多泡状或芽状突起，随后逐渐分离，形成凋亡小体。凋亡小体被临近的细胞或体内吞噬细胞所吞噬,残余物质被消化后重新利用。整个过程最大的特点是质膜始终保持完整，内含物不发生细胞外泄露，

3、不引发机体的炎症反应。5细胞程序性死亡与细胞衰老课件 Morphologi changes:Early:Chromosome condensation,cell body shrink Later:Blebbing and Nucleus and cytoplasm fragment Apoptotic bodies At last:Phagocytosed6细胞程序性死亡与细胞衰老课件染色质聚集分块染色质聚集分块胞质凝缩胞质凝缩染色质集聚染色质集聚细胞器肿胀细胞器肿胀线粒体变为线粒体变为絮状絮状核破碎核破碎形成凋亡小体形成凋亡小体 破裂破裂内含物释放内含物释放炎症炎症被吞噬消化被吞噬消化终有

4、膜封闭终有膜封闭 不引起炎症不引起炎症7细胞程序性死亡与细胞衰老课件A、Normal cell B、Apoptosis:Apoptotic bodies8细胞程序性死亡与细胞衰老课件ApoptosisNecrosisDeath by apoptosis is a neat,orderly process9细胞程序性死亡与细胞衰老课件意义：细胞凋亡对于多细胞生物的个体发育的正常进行，自稳平衡的保持以及抵御外界各种因素的干扰方面都起着非常关键的作用1）清除有机体不再需要的细胞，而不引起炎症反应。2）细胞的自然更新，清除被病原体感染的细胞3）免疫细胞对靶细胞的攻击并引起死亡，也是基于细胞 凋亡4）细

5、胞凋忘失调会导致疾病10细胞程序性死亡与细胞衰老课件11细胞程序性死亡与细胞衰老课件PRIZED Horvitz,and Sulston share Physiology or Medicine Nobel（2002）“for their discoveries concerning genetic regulation of organ development and programmed cell death”1090 131=959(cells)12细胞程序性死亡与细胞衰老课件2002年诺贝尔生理与医学奖获得者年诺贝尔生理与医学奖获得者2002年的诺贝尔生理学和医学奖授予了在器官发育和程

6、序性细年的诺贝尔生理学和医学奖授予了在器官发育和程序性细胞死亡研究领域中做出奠基性贡献的胞死亡研究领域中做出奠基性贡献的3位科学家位科学家:英国的英国的 Sydney Brenner、美国的、美国的 H.Robert Horvitz、英国的、英国的 John E.Sulston他们创造性地用线虫作为实验模型他们创造性地用线虫作为实验模型,实现了对器官发育过程中细实现了对器官发育过程中细胞分裂、分化的原位观察胞分裂、分化的原位观察,完成了细胞图谱的绘制完成了细胞图谱的绘制,在此基础上发现并研究了调控器官发育程序性细胞死亡的关键在此基础上发现并研究了调控器官发育程序性细胞死亡的关键基因及其功能并进

7、一步在高等哺乳动物中发现了相关功能基因。基因及其功能并进一步在高等哺乳动物中发现了相关功能基因。Sydney Brenner H.Robert Horvitz John E.Sulston13细胞程序性死亡与细胞衰老课件Apoptosis induced by Cyto CLane 10 h 21 h 32 h 43 h 54 h 6Control 7Marker 2.0kbp1.00.50.2180200bp DNA ladder细胞凋亡的检测方法形态学观测：台盼蓝、DAPI、Giemsa，DNA电泳，TUNEL测定法，彗星电泳法，流式细胞分析14细胞程序性死亡与细胞衰老课件细胞凋亡的分子机

8、制Early researches(MIT:Robert Horrid,1986)C.elegans:1090 cells,The Finding of CED3 mutantWithout losing any of theircells to apoptosis.CED3 gene play a crucial role in the process of apoptosis.C elegans:a millimeter long,transparent body only a few cell types,from zygote to mature adult only in 3.5da

9、ys.131 cells death.15细胞程序性死亡与细胞衰老课件线虫体细胞凋亡研究：线虫体细胞凋亡研究：PCD相关基因相关基因15个，分为四组：个，分为四组：1、与PCD有关的基因，负责PCD控制：ced-3、ced-4和ced-9。2、与PCD过程吞噬作用有关：ced-1、ced-2、ced-5-8 和 ced-10。3、核酸酶基因（nuc-1）,控制DNA降解，但非PCD所必须。4、影响特异细胞类型PCD的基因：ces-1、ces-2、cgl-1、和 her-1.保守性高，在哺乳动物中有相应同源物：Ced-3=ICE,Ced-4=Apaf-1,Ced-9=Bcl-2.16细胞程序性死

10、亡与细胞衰老课件诱导细胞凋亡的因子:物理因子:射线、较温和的温度刺激化学及生物因子：活性氧基团和分子、钙离子载体、维生素K、视黄酸、细胞毒素、DNA和蛋白质合成的抑制剂、正常生长因子的失调及凋亡因子的处理。17细胞程序性死亡与细胞衰老课件 Apoptosis is carried out by a proteolytic system caspase(1)Why called caspase?Active site:CysteineCleavage site:Asparatic acid Cysteine Asparatic acid specific proteaseAps-Xxx天冬氨酸特

11、异性的半光氨酸蛋白水解酶,负责选择性的切割某些蛋白质,切割的结果是使其活化或失活,非完全降解.分为两类,一类为凋亡的起始者,一类为凋亡的执行者.Caspase依赖性的细胞凋亡依赖性的细胞凋亡18细胞程序性死亡与细胞衰老课件Apoptosis can be divided into two phases：Activation phase：The cell responds to“death signals”that commit it to undergoing self-destruction.Execution phase：The death sentence is carried out.

12、Apoptosis cells are recognized by phagocytes because they carry exposed markers,called“eat me”signals.The best studied“eat me”signal is the presence of phosphatidylserine molecules in the outer leaflet of PM of apoptotic cells(by flop-flipase).19细胞程序性死亡与细胞衰老课件 How to activate caspases?All caspases e

13、xpressed as proenzymes ProcaspasesProcaspaseNH2-terminal prodomain:Highly variableLarge subunit(20kD)Small subunit(10kD)How are procaspases activated to initiate the caspase cascade?The activation is triggered by adaptor proteins that bring multiple copies of specific procaspases.3 groups of caspase

14、:1、apoptotic initiators:caspase-2,caspase-8,caspase-9 and caspase-10 2、apoptotic executioners:caspase-3,caspase-6，caspase-7 and 14(morphology change)3、inflammatory mediateors:caspase-1,and caspase-11 20细胞程序性死亡与细胞衰老课件Procaspases are activated by binding to adaptor proteinsThe caspase cascade involved

15、 in apoptosisA.Procaspase activation by proteolytic cleavage.B.Caspase cascade21细胞程序性死亡与细胞衰老课件The target proteins of caspase are the following:More than a dozen protein kinase,including FAK,PKC,and Raf1.FAK disrupt cell adhesion for the apoptotic cell.Lamins.Cleavage of lamins leads to the disassemb

16、ly of the nuclear lamina and shrinkage of the nucleus.Proteins required for cell structure.Such as IF,actin,and gelsilin.Cleavage and inactivation of these proteins lead to changes in cell shape.Induce cell display signals marked it for phagocytosis.22细胞程序性死亡与细胞衰老课件The inhibitor of CAD(Caspase-activ

17、ated Dnase,an endonuclease).Cleavage of CAD inhibitor lead to activation of CAD,once activated,CAD translocates from the cytosol to the nucleus severing DNA into fragments.Enzymes involved in DNA repair.Which are inactivated by caspase cleavage.DNA repair is a homeostatic activity that is inappropri

18、ate in an apoptotic cell.Caspase依赖性细胞凋亡的两条途径：由死亡受体起始的外源途径：死亡配体主要是肿瘤坏死因子家族成员由线粒体起始的内源途径：细胞色素c23细胞程序性死亡与细胞衰老课件 Molecular pathways of apoptosisTwo principle pathways Extrinsic pathwayIntrinsic pathway24细胞程序性死亡与细胞衰老课件(1)Extrinsic pathway:Fas Signaling PathwayFas(also called Apo-1 or CD95)is a member of

19、the tumor necrosis factor receptor(TNFR)superfamily.Receptor-mediated pathway of apoptosisBcl-2 Family(cytoplasmic factors):Bad,Bid,and bax:promote apoptosis;Bcl-X,Bcl-w,and Bcl-2:prevent apoptosis.Internal stimuli:DNA damage,high Ca2+,Oxidative stress25细胞程序性死亡与细胞衰老课件死亡受体死亡受体(TNFR)：TNF/NGF受体超家族，胞外段具

20、有半光氨酸富集的重复区；TNFR-1和Fas的胞内段含68Aa的死亡结构域(death domain,DD)死亡信号死亡信号(death ligands):TNF超家族（TNF,CD5/Fas.）接头蛋白（接头蛋白（Adaptor）:FADD(Fas associated protein with death domain)；TRADD(TNFR associated death domain);Adaptor N端的DED(death effector domain):诱导caspase8活化。Apaf-1:(apoptotic protease-activating factor)线粒体途

21、径的胞質蛋白，含3个功能域个功能域：N端端85Aa,称称CARD(caspase recruiment domain);ced-4 同源区（同源区（320Aa）;C端，介导蛋白与蛋白相互作用端，介导蛋白与蛋白相互作用。26细胞程序性死亡与细胞衰老课件(2)Intrinsic pathway:Mitochondrial pathwayThe mitochondria-mediated pathway of apoptosisVarious types of cellular stressBcl-2 family:Bad or Bax to become inserted into OM of M

22、itRelease of cytochrome c from I-O space of Mit.Form a multisubunit complex;and Caspase Cascade,27细胞程序性死亡与细胞衰老课件28细胞程序性死亡与细胞衰老课件Caspase非依赖性的细胞凋亡:凋亡诱导因子,限制性内切核酸酶G细胞凋亡的调控细胞中存在Caspase抑制因子,能够直接与Caspase活性分子结合,阻止对底物的切割作用细胞存活因子(有丝分裂原和生长因子)NF-kB,抗凋亡,促存活.p53,促凋亡病毒抑制凋亡29细胞程序性死亡与细胞衰老课件（二）细胞坏死 是细胞受到急性强力伤害时立即出现的

23、反应。早期表现为细胞膜破坏，线粒体肿胀。继而溶酶体破裂,细胞内容物流出,引起炎症。细胞凋亡的一种替补方式。（三）细胞自噬 个体遭遇营养危机时，是细胞凋亡的一种补充途径二.植物细胞与酵母细胞的程序性死亡30细胞程序性死亡与细胞衰老课件衰老（aging，senescence，senility）：又称老化，通常指生物发育成熟后，在正常情况下随着年龄的增加，机能减退，内环境稳定性下降，结构中心组分退行性变 化，趋 向 死 亡 的 不 可 逆 的 现 象。衰老和死亡是生命的基本现象，衰老过程发生在生物界的整体水平、种群水平、个体水平、细胞水平以及分子水平等不同的层次。生命要不断的更新，种族要不断的繁衍。

24、而这种过程就是在生与死的矛盾中进行的。至 少 从 细 胞 水 平 来 看，死 亡 是 不 可 避 免 的。第二节第二节 细胞衰老（细胞衰老（cellular aging;cell senescence）31细胞程序性死亡与细胞衰老课件一、早期的细胞衰老研究（细胞一、早期的细胞衰老研究（细胞“不死性不死性”观点）观点）1、100年前，魏斯曼曾提出种质不死而体质会衰老和死亡的学说（将原生动物的衰老除外），但原生动物的“不死性”也是不成立的，因为新细胞中存在着老化的结构成分。2、Carrel和Ebeling宣称培养的鸡心脏细胞可以无限制地生长和分裂（已连续培养34年）认为细胞本身不会衰老,衰老是由于

25、环境的影响造成的。（后来Hayflick认为Carrel每次向培养基中加入的鸡胚提取物中可能混有新鲜的细胞）3、20世纪40-50年代，L系小鼠细胞和Hela细胞系的建立使细胞不死性的观点更加巩固。（L系小鼠细胞和Hela细胞系是不正常的细胞）32细胞程序性死亡与细胞衰老课件二、二、Hayflick界限（细胞增殖能力和寿命有限的界限（细胞增殖能力和寿命有限的观点）观点）60年代初，Hayflick等人的出色工作提出了细胞增殖能力和寿命有限的观点，同时发现物种寿命和培养细胞寿命之间存在着确切的相互关系。Hayflick界限：细胞,至少是体外培养的细胞，不是不死的，而是有一定寿命的，它们的增殖能力

26、不是无限的，而是有一定的界限。（适用于很多种类型的细胞）33细胞程序性死亡与细胞衰老课件l1961，Hayflick&Moorhead报告：人成纤维细胞培养只能传代4060次。l该结果后来被其他研究者所证实。34细胞程序性死亡与细胞衰老课件l细胞的增殖能力和供体的寿命正相关：lHayflick：胎儿的肺成纤维细胞可传50代，成人的只能传20代。lGalapagos龟：寿命175岁，传代90-125次；小鼠：寿命：3.5岁，传代14-28次。lGoldstein：儿童早老症（Hutchinson-Gilford Syndrome）患者的成纤维细胞体外培养只能传代24次（寿命只有12-18岁）。W

27、erners Syndrome患者具有类似现象。35细胞程序性死亡与细胞衰老课件Werners syndrome 头发灰色、细弱、鹰钩鼻。36细胞程序性死亡与细胞衰老课件Werners syndrome (a Japanese)14岁48岁37细胞程序性死亡与细胞衰老课件Hutchinson-Gilford syndrome progeria disease38细胞程序性死亡与细胞衰老课件体外培养细胞的衰老控制体外培养细胞的衰老控制l决定因素在细胞内部：Hayflickl老年男性的细胞和年轻女性的细胞（间期有Barr body)混合培养：年轻女性的细胞传代次数多。（培养环境相同）l细胞核决定了

28、细胞衰老：Wright&Hayflickl老年胞质体年轻细胞核：杂交细胞分裂能力强；l年轻胞质体老年细胞核：杂交细胞分裂能力弱。39细胞程序性死亡与细胞衰老课件三、细胞在体内条件下的衰老三、细胞在体内条件下的衰老1、在机体内，细胞的衰老和死亡是常见的现象，甚至在个体发育的早期也会发生；2、衰老动物体内，细胞分裂速度显著减慢，其原因主要是G1期明显延长；3、衰老个体内的环境因素影响了细胞的增殖和衰老；40细胞程序性死亡与细胞衰老课件四、细胞衰老的特征四、细胞衰老的特征1、形态变化l 细胞核l 体积增大；核膜内折；染色质固缩化l rER减少（尼氏体消失）l 线粒体数量减少，体积增大l 致密体den

29、se body积累l 又叫脂褐质、老年色素、残体、血褐质等。l 来自溶酶体和线粒体l 膜系统：流动性下降，常处于凝胶相或固相。l 间隙连接减少，组成间隙连接的膜内颗粒聚集体变小。41细胞程序性死亡与细胞衰老课件2、分子水平的变化衰老细胞会出现脂类、蛋白质和DNA等细胞成分损伤，细胞代谢能力降低42细胞程序性死亡与细胞衰老课件五、细胞衰老的分子机制（原因及假说）五、细胞衰老的分子机制（原因及假说）90年代以来，细胞衰老分子机制研究的重大进展：单基因的突变导致寿命的显著延长；端粒和端粒酶与细胞衰老关系的发现等。60年代起开始出现的一系列衰老理论：1、氧化性损伤学说（自由基理论）Harman 50年

30、代（1956）提出。认为代谢过程中产生的活性氧基团或分子（reactiveoxygenspecies,ROS）引起脂质、蛋白质和核酸分子的氧化性损伤的累积，引起细胞功能的多方面异常。正常细胞内存在清除自由基的防御系统，如超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)等。根据该理论：清除ROS，就可以减缓衰老。超级表达SOD和过氧化氢酶的转基因果蝇的寿命延长了34%;将人的SOD基因转入果蝇体内，其寿命延长一倍。反例：将小鼠的谷胱苷肽过氧化物酶或SOD酶剔除一种，并未引起细胞衰老的加速。43细胞程序性死亡与细胞衰老课件2、端粒与衰老 Harley,1990发现端粒的长度确实与衰老有着密切的关系，

31、提出细胞衰老的“有丝分裂钟”学说。端粒长度随细胞衰老过程而逐渐缩短，但端粒酶却可维持端粒的长度。实验证据实验证据1 1：1990，Harley等人发现，体内端粒长度随人的年龄增长而缩短；体外培养的细胞中，端粒长度随分裂次数增加而减小。实验证据实验证据2 2：1998，Wright等人，将人的端粒酶基因转入人的2n的体细胞，结果发现细胞端粒长度增加，分裂旺盛，细胞衰老指标的酶含量降低，细胞寿命延长20代。疑问疑问1 1：1998，Carman，2n仓鼠的胚细胞，始终表达端粒酶，端粒长度恒定，但2030代后仍进入衰老。疑问疑问2 2：某些小鼠终生具有较长的端粒，但寿命并无明显延长；剔除其短粒酶基因

32、后也未表现出早衰症状。44细胞程序性死亡与细胞衰老课件3、rDNA与衰老：酵母染色体外rDNA 环（ERC）的积累，导致细胞衰老。4、沉默信息调节蛋白复合物与衰老：Sir complex（silencing information regulator complex）存在于异染色质区，其作用在于阻断所在位点DNA转录。1994年，Kennedy等在酵母中发现：Sir complex的变异导致其由端粒等处向核仁转移，伴随着细胞寿命的延长。核仁沉默与寿命延长有关。5、SGS1基因、WRN基因与衰老 SGS1基因（酵母）和WRN基因（人类）同源,编码DNA解旋酶，是保证细胞正常的生命周期所必需的，突

33、变会引发DNA复制障碍，引起衰老的提前发生和寿命的缩短。sgs1突变体寿命明显短于野生型（平均9.5代:24.5代）;WRN突变引发早老症。45细胞程序性死亡与细胞衰老课件6、发育程序与衰老线虫的研究发现：一般线虫在幼虫期持续4天，然后达到性成熟并进入成虫期，延续数周后衰老死亡。不良环境会使幼虫进入一种称为dauer幼虫的阶段，可延续6个月。Daf2、age1、daf16基因与dauer幼虫的形成有关。7、线粒体DNA与衰老 80年代，Cummings等人提出，mtDNA突变积累与细胞衰老有关；电子传递链受阻。8、衰老因子积累说，亦称“蛋白质合成差错成灾说”Megbegeeb（1962）org

34、el（1973）提出，认为有缺陷的酶干扰复制、转录、翻译等水平错误积累直至成灾46细胞程序性死亡与细胞衰老课件9、基因调节Smith假说衰老细胞+年轻细胞异质双核细胞（年轻细胞核DNA合成受抑制）衰老细胞+Hela细胞异核体（衰老细胞被诱导合成DNA）说明：衰老细胞产生了DNA合成抑制剂，穿过胞质，影响正常年轻细胞核中DNA合成；Hela细胞则不受这种抑制剂的影响，相反，它们产生DNA合成起始因子，并诱导衰老细胞核的DNA合成。10、大脑的衰老中心：近年来，Franks，Finch等，提出在大脑存在一个“衰老控制中心”，这就是神经内分泌轴（下丘脑垂体内分泌系统）调控机体各种生理功能。小结：近20年来，细胞衰老的研究取得了长足的进步，但离开真正揭示细胞衰老的本质，还要走很长的路。47细胞程序性死亡与细胞衰老课件