抗体的选择和保存

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1、抗体的选择和保存当我们要检测目的蛋白在组织中表达情况的时候，如何选择适合我们实验需 要的抗体，并恰当保存使用，是每个科研人员需要细心考虑的。抗体种类繁多， 品牌众多，技术参数不一，价格和质量更是相差甚大，如何购买到高质量价格合 适的抗体，并准确地做出我们想要的结果，其中有很多细节需要注意。一、怎样选择适合你实验需要的抗体1. 一抗选择要点(1) 确定抗体的名字，注意中英文名字、它名、亚型等信息。(2) 确定你的实验类型，ELISA, WB, IHC, ICC,还是FACS。一般抗体的说 明书都会列出该抗体经验证过适用于何种实验的类型，如果抗体说明书没有提及 的应用类型,并不意味着该抗体不适用于

2、此种分析应用类型,而仅是说明尚未经 过此种实验验证,请根据说明书列出的已验证的类型来选择适合你实验的抗体。(3) 确定实验样本的种属，Human, Mouse，还是Rat。一般抗体说明书都列出 该抗体经试验验证过适用于何种物种实验,请根据说明书列出已验证的种属来选 择适合你实验的抗体。对于免疫组化而言,尽可能选择与样本不同种系物种的一 抗,从而避免二抗与样本内源性免疫球蛋白产生交叉反应,例如：检测小鼠样本 蛋白,则不应选择小鼠或大鼠源的一抗,最好选兔源的一抗,则二抗则可选择偶 联了检测分子(酶、荧光素、生物素等)的抗兔 IgG。(4) 样本蛋白的结构性质。了解样本蛋白的结构性质有助于选择最合适

3、的抗体, 待测样本蛋白的结构域和样本在提取和处理过程中是否会变性,蛋白空间构象的 改变,会影响抗体的免疫亲和反应。抗体是由各种不同免疫原免疫宿主而制备得 来,其中的免疫原包括：全长蛋白、蛋白片断、多肽、全有机体(如：细菌)或 细胞,抗体说明书一般都有免疫原的描述,如果打算检测的是蛋白片断或一种特 殊的同型物或蛋白全长的某一区域,则必须选择用含此片段域的免疫原制备出的 抗体。如果打算用 FACS 流式检测活细胞的表面蛋白,则需要选择含该表面蛋 白的胞外域来免疫制备的抗体。( 5)单多克隆抗体的选择。市面上的抗体还是以多克隆抗体为主,一般单克隆 抗体特异性强,但亲和力相对小,检测抗原灵敏度相对就低

4、；而多克隆抗体特异 性稍弱，但抗体的亲和力强，灵敏度高，但易出现非特异性染色（可以通过封闭 等避免）。（6）单克隆与多克隆抗体的区别单克隆与多克隆抗体的区别这首先要从抗体的产生来探讨。把某一抗原免 疫某种动物而得到单抗或多抗。如果用经免疫过的动物的脾细胞获得杂交瘤细 胞，则得到单克隆抗体，如果用动物的血清，则得到多克隆抗体。但从理论上说，这些抗体都应针对抗原来自的动物，例如如果用人蛋白抗 原免疫小鼠，则这些抗体为鼠抗人。由于一个大蛋白分子表面具有多种抗原决定 簇，因此，免疫动物后，这些不同的决定簇分别诱导动物产生不同的抗体，每种 抗体的特异性不同。单抗是有单个细胞起源的细胞克隆分泌的，所以只针

5、对蛋白 抗原的单一抗原决定簇，而多抗是有多个不同克隆的 B 细胞产生的，是多种细 胞的混合物，但其中的每一种抗体也只是针对一种决定簇。多抗混合物中的每一 抗体与蛋白抗原结合的能力是不同的，因此用多抗做实验与用单抗可有其优势， 那就是能确保抗体与抗原结合从而显示抗原信息。但也有其缺点，那就是交叉反 应，往往造成假阳性。2. 二抗选择要点 （1）种属来源。主要根据一抗种属来源来决定购买二抗来源，如一抗是小鼠来 源，那二抗就买抗小鼠的即可（羊、兔等均可）。（2）标记物的选择。有HRP、Biotin、荧光素等标记物。一般SP三步法二抗选 择Biotin标记的二抗，以与后面的SP结合反应，而免疫荧光染色

6、就需要购买不 同荧光素标记的二抗，如罗丹明、 FITC、 Cy3 等常用荧光素。二、抗体的稳定性1. 抗体的稳定性是自然界长期进化的结果。抗体是免疫系统中最重要的分子之 一，其稳定性是自然进化筛选的结果。在众多物种中，抗体分子形成了保守而稳 定的结构。2. 抗体分子的高Tm值。在室温下，甚至短时间温度达到50-60C，抗体分子都 能维持正确折叠，保持应有的活性。3. 抗体的纯度。采用先进的抗体纯化技术，确保抗体产品的高纯度，保障其抗 体产品的稳定性。4. 抗体的浓度。高浓度的抗体产品可减少容器表面吸附造成的物质损失，高浓 度的抗体稳定性更好，抗体产品中 93%的浓度大于 0.5mg/ml。三、

7、怎样确定抗体购买渠道和品牌 国外著名抗体品牌的质量一般没问题，但价格较贵，而且很多抗体品牌本身不生 产抗体，所以能找到 OEM 抗体生产商生产的原装进口抗体，如美国的 ProSci 公司，大部分常用抗体都可以在 ProSci 网站上查找到，同样一支抗体能少花费 1000 元，对于一个普通实验室来说，那将节约非常多的科研经费，而且 ProSci 会提供信号通路的小包装抗体作为一个试剂盒，这样极大方便了用户，特别是经 费不是很充足的用户。随着网络技术的越来越普及，我们自己就可以通过国内外 的相关网站来检索，国外最大的生物试剂查询网站：biocompare，国内最大的生 物试剂查询网站：丁香通，来查

8、找我们所需要的产品资料。四、怎样保存已获得的抗体 抗体无论是保存还是运输都应尽可能地避免反复冻融，收到抗体后请根据实验的 需要，对抗体进行分装，避免同一管抗体反复冻融（反复冻融会导致抗体空间结 构变性，导致多聚体形成，从而降低抗体的结合能力）。抗体保存得当与否，直 接决定了抗体的活性和使用效果，如果抗体保存得当，抗体活性大部分都可以维 持数年。请谨记，无论何时请按照说明书推荐的保存条件正确处理和保存抗体。1. 收到抗体后，请务必在4C, 12000rpm，离心3分钟，（无论是液体还是冻 干粉状态），再打开管盖进行分装和保存（如果抗体体积小于50u 1,请延长离心 时间至 5 分钟，以保证全部抗

9、体均离心下来）。抗体一般使用特制的储存管，只 有在 12000rpm 离心 3 分钟，才能将附着在管壁或盖内的抗体全部离心下来（即 使是在 10000rpm 离心也会离心不完全，导致出现抗体的量不足的现象）。2. 对于ProSci大部分抗体，比较合适的保存方式是，分装后保存在-20C或者 -80C。（1）对绝大多数抗体来说，保存在-20C就完全足够了，没有任何证据显示保存 在-80C会更好。（2）分装可以最大程度的降低反复冻融对抗体活性的损害，同时也降低了由于 多次从同一管中吸取抗体造成的污染可能性。(3) 分装的量以一次实验用完为好，最少不能少于10ul每份。因为分装体积越 小，抗体的浓度越

10、可能会受到蒸发以及管壁吸附的影响。(4) 复融后的分装抗体如果一次用不完，将剩余母液保存在4C,避免再冻起 来。(5) 抗体工作液应该当天配制当天用完，4C保存尽量不要超过1天。( 6)绝对避免将抗体保存在自动除霜冰箱中，将抗体保存在冰箱里层，避免温 度变化造成反复冻融。3. 大部分抗体收到后4C短暂保存12周对抗体活性没有影响。4. 大部分抗体的运输条件：一般的运输过程需要 12 周的时间，所以是在低温4C的条件下来完成的。4C运输最主要的目的是为了避免反复冻融对抗体活性的损害(如果使用干冰运 输，那么收到时抗体是冻起来的，为了分装就需要解冻，这就多了一次冻融的过 程)，所以运输过程中绝对避免干冰运输。五、关于叠氮化钠(sodium azide的使用：为了防止微生物污染，叠氮化钠经常被加入到抗体中(终浓度 0.02% (w/v)。ProSci 的绝大部分抗体已经含有了 0.02-0.05%的叠氮化钠，在说明书的储存缓 冲液中有标明。注：叠氮化钠的去除方式可以通过凝胶电泳或过滤的方式去除,IgG的分子量是150kDa(IgM约600kDa)； 叠氮化钠的分子量只有65Da,使用截留分子量为14kDa的滤膜即可将叠氮化钠 从抗体中去除。