结核分枝杆菌实验室检测方法

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1、结核分枝杆菌实验室检测 方法 分枝杆菌属 一类细长略带弯曲，有时呈分枝状的杆菌，本属 细菌多具有抗酸性，又称抗酸杆菌（ acid-fast bacillus），细菌体内含有分枝菌酸，细胞壁含有 大量脂类，这与分枝杆菌的染色性、抵抗力和致 病性等密切相关。 本属细菌已经被鉴定的有 70多种，可分为三大类： 结核分枝杆菌、非典型分枝杆菌、麻风分枝杆菌 ； 按生长速度可分为三类，即缓慢生长菌、迅速生 长菌和不能培养菌三种类型 结核分枝杆菌群 结核分枝杆菌，是人和动物结核病的病原体，包 括人结核分枝杆菌（ Mycobacterium tuberculosis）、 牛分支杆菌（ M.bovis）、非洲分

2、支杆菌 （ M.africanum）和田鼠分枝杆菌（ M.microti）， 前三种对人类治病，其中人型结核分枝杆菌感染 发病率最高。 结核分枝杆菌属于缓慢生长分支杆菌 非典型分枝杆菌 偶发分枝杆菌、龟分枝杆菌龟 /脓肿 、 胞内分枝杆 菌、鸟分枝杆菌、戈登分枝杆菌、堪萨斯分枝杆 菌、偶然分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、浅黄分枝杆 菌、土分枝杆菌、草分枝杆菌、不产色分枝杆菌、 海 -溃疡分枝杆菌、金色分枝杆菌、苏尔加分枝杆 菌、蟾蜍分枝杆菌等 偶发分枝杆菌、龟分枝杆菌龟亚种、龟分枝杆菌 脓肿亚种属于迅速生长型，鸡蛋培养基上 3-5天可 见菌落 其他非典型分枝杆菌多为缓慢生长型 麻风分枝杆菌 麻风分枝杆

3、菌（ M.leprae）是麻风病的病原体，也是抗酸 杆菌，但较结核分枝杆菌 短而粗，两端尖细 ，抗酸染色着 色均匀，呈 束状或团状 排列，结核分枝杆菌多散在，偶有 聚集。为典型的胞内寄生菌，有麻风杆菌存在的细胞胞浆 呈泡沫状，称麻风细胞。 体外不能培养。 全球约有 1/3的人口已经感染结核分枝杆菌，有 2000万活动性肺结核患者，每年新发病例 900万 人，每秒钟有 1人感染结核，每年有 300万人死 于结核病。 随着抗结核药物的不断发展和卫生生活状况的 改善，结核的发病率和死亡率曾一度大幅下降 20世纪 80年代后，由于艾滋病和结核分枝杆菌 耐药菌株的出现、免疫抑制剂的应用、吸毒、 贫困及人

4、口流动等因素，全球范围内结核病的 疫情骤然恶化 结核分枝杆菌 6 生物学形状 结核分枝杆菌为 细长略带弯曲的杆菌 ，有时可见 分枝状，无芽孢和鞭毛，因衰老或抗结核药物的 作用可出现多形态，如球状、串珠状或丝状， 大小为 1 4X0.4m。 细胞壁中含有大量脂质而不易着色，特别是有 大量分枝菌酸包围在肽聚糖层的外面，一般 用抗酸染色。 萋尼染色呈红色 ，背景为蓝色 ； 荧光染料金胺“ O”染色，荧光显微镜下为橘黄色 培养特性 培养基 营养要求高， 必须在含血清，卵黄，马铃薯， 甘油及无机盐类的特殊培养基上生长， 常用的 有罗氏固体培养基 培养条 件 专性需氧， 3%-5%CO2能促进其生长 最适

5、温 度为 35-37 ， 最适 pH为 6.5-6.8 菌落特 点 菌落 粗糙型，表面干燥成颗粒状，不透明，乳 白色或淡黄色，菜花样 8 实验室检测方法 萋尼染色 +荧光染色 罗氏培养 +分枝杆菌快速培养 抗原抗体检测 细胞因子检测 荧光定量 PCR 芯片杂交 病原学 免疫学 分子生物学 涂片镜检 -抗酸染色 抗酸染色是目前为止最快的结核检出方法，可用来检测病 情进展，为感染控制提供参考依据，可确证培养物为阳性 萋尼染色法 红色 普通显微镜（高倍） 荧光染色 黄或橘色 荧光显微镜（低倍） 联染法：敏感性高，特异性好，速度快！ 抗酸染色局限性 抗酸染色对分枝杆菌非特异，其他如 Nocardia（

6、奴卡）、 Rhodococcus（红球菌属）、 Legionella micdadei（军团 菌）、 cryptosporidium（隐孢子虫）、 Isospora（等孢球虫） 等有抗酸菌特点 不能区分结核和非结核分枝杆菌 不能区分活菌和死菌 敏感性差，一般 1mL痰中有 5000-10000条菌时可检出，而 培养可检出 10-100条菌 . 发光二极管荧光显微镜（ LED） 荧光显微镜成本高、易损坏、耗电量大、光源寿命短、显 微镜价格昂贵且需要在暗室内工作等，荧光染色法一直没 有在结核病痰涂片诊断中得到广泛的应用。 只需将二极管替换普通光学显微镜的目镜就相当于一台荧 光显微镜，组装的“荧光显

7、微镜”结合金胺 O染色在结核 病痰涂片检查中有一定的应用价值。 田斌等，发光二极管荧光显微镜在基层实验室诊断结核分枝杆菌的应用评价 . 实用预防医学 2012年 10月第 19卷第 10期 . 分枝杆菌培养技术 结核菌培养仍是目前诊断的金标准尤其是药敏 试验结果在指导临床用药及耐药性检测等方面具 有重要作用 , 是鉴定是否为活菌的可靠方法 1、传统的固态培养法 需要 4 6周才能检测到结核菌的生长而且阳性 率也只有 30 -40；特异性差各种分枝杆菌均可 生长。要确定是否为结核菌需结合分枝杆菌菌种 鉴定和药物敏感性试验。 2、 分枝杆菌快速液体培养技术 BD公司推出的 BACTECMGIT 9

8、60全自动分枝杆菌培养，鉴 定药敏系统，操作简便，阳性标本检出时间平均为 9d： 鉴定、药敏试验时间平均为 4d：阳性标本检出率比传统固 体培养提高 10左右 固体培养和液体培养优缺点 固体培养：污染少，易于进行菌落形态观察，但是培养时 间长 液体培养：菌体与培养基充分接触，生长迅速，但易受到 污染 血清学试验 免疫学检测方法 1、结核菌素试验 凡感染过结核杆菌的机体，会产生相应的致敏淋巴细胞， 具有对结核杆菌的识别能力，当再次遇到通过皮肤注入的 少量的结核菌素时，致敏 淋巴细胞受相同抗原再次刺激 会在 48-72小时内，产生局部炎症反应，出现红肿硬节即 为阳性反应。 对活动性结核的诊断灵敏度

9、高达 77， 局限性： 假阴性： 小儿结核、老年人结核、免疫缺陷或免疫功能低下患者 （如合并 HIV感染、接受免疫抑制剂治疗的患者 ) 假阳性： 接种过卡介苗的人也会产生阳性反应 干扰素释放试验 被认为是近十年来结核诊断史上取得的最重要成就，该检测 方法的原理是：结核感染后体内长期存在抗原特异性的记忆 性 细胞，当再次遇到抗原刺激时，能迅速活化增值，释放 干扰素。 目前市售两种， QFT-G和 T-SPOT.TB，比较两种方法， T- SPOT.TB更灵敏但 QFT-G更特异，但均优于结核菌素试验，同 时也被推荐用于潜伏结核诊断。 分子生物学检测方法 近年来核酸扩增技术和杂交分析技术的发展，为

10、分枝杆菌 的检测、鉴定和药敏实验提供了极大的方便，可将诊断时 间从几周降低到几天。研究、应用报道较多的结核病基因 诊断技术主要包括聚合酶链反应 (PCR)、核酸探针杂交、 DNA序列测定、基因芯片、基因分型等。 分枝杆菌核酸检测 分枝杆菌菌种鉴定 结核分枝杆菌耐药基 因检测 MDR早期诊断 分枝杆菌分子诊断系统（协和医院） 菌种鉴定 筛查、鉴别诊断 实时荧光 PCR 基因芯片快速检测平台 高 效： 一个样本可 同时 检测结核分枝杆菌和 NTM 快 速： 4周（菌培） 3 小时 灵 敏： 10 个菌 /反应（ TB）； 102 个菌 /反应（ NTM） 22 分枝杆菌核酸检测 功能： TB快速筛

11、查； TB/NTM鉴别诊断 高 效 ： 同时检测 17 种分枝杆菌（包括 TB） 快 速： 4周（菌种鉴定） 6 小时 灵 敏： 103 个菌 /反应 检测范围 ：结核 、 胞内 、 鸟 、 戈登 、 堪萨斯 、 偶然 、 瘰疬 、 浅黄 、 土 、 龟 -脓肿 、 草 、 不产色 、 海 -溃疡 、 金色 、 苏尔加 、 蟾蜍 、 耻垢 。 23 分枝杆菌菌种鉴定（ DNA微阵列芯片法） 通 量： 两个一线抗结核药（ MDR） 速 度 ： 8周（药敏） 6 小时 灵敏度： 103 个菌 /反应 基于 rpoB（ 利福平 ） 和 katG/inhA（ 异烟肼 ） 的基因突变 ， 对 耐多药结核

12、病 做出快速诊断 。 24 结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒 高会霞等，五种结核病实验室检测方法对结核病诊断价值的 效果评价 .实用检验医师杂志， 2012， 4（ 3）： 157-160. 五种结核检测方法效果评价 结核组： 1260例 非结核组： 100例 改良罗 氏培养 荧光 PCR 涂片法 MGIT 960 快速培养 结果比较 斑点层析法 敏感性、特异性比较 罗氏培养和快速培养 快速培养和荧光 PCR 总结： 涂片简单快速但阳性率较低、难以区分结核和非结核分枝 杆菌 培养为金标准，但需时较长 血清学试验检测结核抗原或抗体不太理想 干扰素释放试验能较好地为临床服务 荧光 PCR检测结核分枝杆菌具有较好的敏感性和特异性， 可结合传统方法综合分析 Thank You!