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1、2013年 9月 一种新的膀胱癌原位移植瘤动物 模型的建立 A new method of establishing orthotopic bladder tumor in mice for experimental therapies 一、研究目的和意义 膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，术后高复发率 是临床治疗失败的主要原因。 根据膀胱癌易复发的特点，行术后药物膀胱灌注可以达到 清除残余瘤体，预防复发的目的。 因此寻找一种能有效清除膀胱癌术后残余瘤体的 药物具有重要意义。 研究药物在动物体内对膀胱癌术后复发的预防效 果，首先必须建立一种 简便 、稳定 、可靠 的膀胱 癌原位移植瘤动物模
2、型。 原位膀胱癌动物模型的制备方法 目前 常用的制备膀胱 癌 原位移植瘤动物模型 的方法按接种方法不同 可分为四 种 ： 1. 将致癌剂 注入膀胱腔内 引发肿瘤。 缺点： 肿瘤多发 ， 且定位不确定。 2. 将 化学物质（酸、碱或酶） 注入膀胱腔内造成膀 胱粘膜损伤后再注入肿瘤细胞 。 缺点 ：成瘤率低、操作繁杂，损伤面积大，可能 造成严重并发症，对动物损伤非常大 。 3. 经腹部膀胱壁内注射肿瘤细胞。 缺点：需要手术， 操作复杂 ，对动物 损伤严重 ， 且 肿瘤细胞易漏入盆腔和腹腔。 原位膀胱癌动物模型的制备方法 4. 用机械方法造成膀胱粘膜损伤后再灌注肿瘤细胞 该方法对动物损伤小；肿瘤细胞
3、可以定植在损伤 部位，因此成瘤部位确定；且该模型 与临床膀胱 肿瘤病理过程相似 ， 能 准确 反应出肿瘤 的 生长、 浸润 。 原位膀胱癌动物模型的制备方法 （ 1）杨慎敏等采取 腹正中切口，暴露膀胱， 自尿 道插入 动脉穿刺套管针套管，插入针芯， 在直视 下用 小镊子提起膀胱 并轻轻移动，使 针芯划伤膀 胱 左侧壁 2 3 次，退出针芯，注入肿瘤细胞。 缺点：需要进行手术， 操作复杂 ，对动物 损伤严 重 。 （ 2） Bisson J F等 将自制的摩擦装置通过套管经 尿道置入膀胱 ，感觉针头抵达膀胱壁后用针芯旋 转损伤膀胱粘膜，然后注入肿瘤细胞 。 缺点： 未对针芯旋转的程度给予限制，造
4、成的膀 胱粘膜损伤无可控性。 我们采用偏角针膀胱粘膜损伤方法，成功建立了 膀胱 癌 原位移植瘤动物模型，为膀胱癌防治研究 提供了一种有实用价值的膀胱癌动物模型的制备 方法。 应用该造模方法成功验证了我们研制的一种膀胱 灌注液（苏复宁洗液）预防膀胱癌术后复发的作 用效果。 材料与方法 1. 偏角针的制备 24#静脉留置针，取出针芯，在距针尖 15mm处将针芯 折约 5-7度的偏角，旋转针芯时针尖处可形成 = 2.613.66 mm的圆。 偏角针 正常针芯 套管 24#静脉留置针 2.细胞株及实验动物的选择 小鼠膀胱癌细胞株 BTT，由山西医科大学第一临床医院泌 尿外科杨晓峰教授惠赠。 T739近
5、交系小鼠，雌性， 46周龄， SPF级，购自北 京华阜康生物科技股份有限公司，许可证号： SCXK(京 )2009-0004。 人膀胱癌细胞株 T24，购自中科院上海生命科学研究院。 BALB/c-nu-nu裸鼠，雌性， 46周龄， SPF级，购 自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号： SCXK(京 )2009-0017。 3. 肿瘤细胞原位接种方法 实验动物 下腹部常规消毒 经尿道口缓慢 插入膀胱腔内 一手固定套管 ， 另 一手转动针芯 5周 偏角针缓慢插 入套管中 麻醉 戊巴比妥钠 60mg/kg 24#静脉留置 针套管外涂以 液体石蜡 抽出尿液 拔出针芯 注入肿瘤细胞悬液 0.1
6、ml（含有 1 107个细胞） 待动物自然苏醒 拔出套管 实验组 对照组 图 1 膀胱粘膜未损伤与损伤后的小鼠膀胱（充盈） （左：膀胱粘膜未损伤； 右：膀胱粘膜损伤） 4. 观察方法 接种后动物常规饲养 ， 观察动物的活动 、 体重变化 ， 记 录 动物生存时间 ， 动物自然死亡后解剖 ， 观察两种方法造模 后膀胱腔内有无肿瘤形成 、 肿瘤转移及血尿形成 ， 剖取膀胱 ， 并对膀胱及有肿瘤转移的脏器以 10%甲醛溶液固定后作病理 检查 。 表 1 偏角针损伤与不损伤膀胱粘膜的膀胱原位移植瘤成瘤率比较 组别 动物数量 （只） 细胞接种量 成瘤数量 （只） 成瘤率 (%) T739 未损伤组 10
7、 1 106 0 0 T739 损伤组 60 1 106 60 100 Balb/C-nu-nu 未损伤组 10 1 106 0 0 Balb/C-nu-nu 损伤组 60 1 106 60 100 结果 1. 肿瘤形成情况 图 2 膀胱早期与晚期肿瘤 (左：早期膀胱肿瘤；右：晚期膀胱肿瘤 ) 早期肿瘤较为表浅，晚期肿瘤充满整个膀胱。 图 3 原位膀胱癌肝转移与肾转移 (左：肝脏转移；右：肾脏转移 ) 2. 肿瘤转移情况 T739小鼠接种后有 23%的动物肉眼可见肝脏、肾脏、肠系膜、腹膜等处 有转移，转移灶可为多处或单处 ， 同时伴有血性腹水，腹腔内有粘连现 象。 BALB/c-nu-nu裸鼠
8、只有一只可见肾脏转移 。 图 4 T739 小鼠 与 Balb/C-nu-nu裸鼠生存时间图 (左： T739 小鼠；右： Balb/C-nu-nu裸鼠 ) 3. 动物生存时间 表 3 膀胱原位移植瘤模型动物平均生存时间 组别 动物数量 （只） 平均生存时间 （ d） T739未损伤组 10 40 T739 损伤组 60 26.69 9.24* Balb/C-nu-nu 未损伤组 10 60 Balb/C-nu-nu 损伤组 60 34.59 9.80* 图 5 膀胱肿瘤及肝肾转移病理学形态 A 正常膀胱 ( 100) C 晚期原位膀胱肿瘤 ( 100) B 早期原位膀胱肿瘤 ( 100) D 肾脏转移 ( 200) 4. 病理学检查结果 讨论 偏角针旋转可以在膀胱粘膜上形成一个均衡的损伤 。 接种早期即可有大量的肿瘤细胞定植 ， 在较短时间内就可 形成肿瘤并发生脏器转移 。 制备偏角针所采用的 24#静脉留置针为标准的医用器械 ， 易于获得且标准统一 偏角针的制备方法简单 ， 实验操作简单 ， 对膀胱粘膜的损 伤程度容易控制 用该方法建立膀胱癌原位移植瘤模型具有接种成瘤率高 、 对动物损伤小等优点 。 结 论 采用偏角针旋转法损伤膀胱粘膜可以建立一 种简便 、 可靠 、 稳定的膀胱癌原位移植瘤动物模 型 。 欢 迎 各 位 专 家 批 评 指 正！
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