抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性测定方法

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1、抗氧化酶（SO、PD、CA）活性测定措施一、 超氧化物歧化酶(SOD）活性测定（氮蓝四唑光化还原法）、试剂的配制（1)005molL磷酸缓冲液(B，pH7.)：A母液：.2mo/L磷酸氢二钠溶液: 取Na2HPO412H（分子量3581)71.7;母液：0.2o/L磷酸二氢钠溶液：取N2PO4H2O(分子量156）31.2g。分别用蒸馏水定容到100ml。0.5mol PBS(pH.8)的配制:分别取母液(PO4） 228.5m，B母液(aH2PO4)21.2l，用蒸馏水定容至10ml。加入0gPV（聚乙烯吡咯烷酮）参照文献:李合生主编：植物生理生化实验原理和技术高等教育出版社，：26268。

2、()3mol/甲硫氨酸溶液:取19 Me用磷酸缓冲液(pH7.)定容至10。网上说定容到100L我也不懂。拜托(3)10mol/L E-N2溶液：取0.032g A-Na用磷酸缓冲液定容至100ml；(4)10M核黄素溶液:取0.05g核黄素用蒸馏水定容至10ml，避光保存,随用随配，并稀释1倍(5）750ml/L氮蓝四唑(NBT)溶液：称取0.63 NT用磷酸缓冲液定容至10避光保存；酶液制备:取一定部位的植物叶片（视需要定,去叶脉）0g于预冷的研钵中，加2ml磷酸缓冲液在冰浴下研磨成浆，加缓冲液使终体积为10ml。取5于10000r/min下离心10min，上清液即为O粗提液。提取酶液时如

3、何保存;如果没有测完的需要放在4的冰箱里。2、酶活性测定.显色反映 取试管（规定透明度好)5支，3支为样品测定管,1支为对照管，此外1支作为空白，按表391加入各溶液。混匀后将空白管置暗处，其他各管于000lx日光灯下反映20min(规定各管受光状况一致，反映室的温度高时时间可合适缩短,温度低时时间可合适延长)。表391 各溶液加入量试 剂（酶）用量()终浓度（比色时）0.05mol/磷酸缓冲液10molL Met溶液50m/L T溶液100molLETANa2液20m/L核黄素酶 液蒸馏水总体积10.3030.0.5 05.13mmol5ml10ol.mol空白和对照管加缓冲液替代酶液加核黄

4、素时记得要快并且要避光,SO活性测定与计算 至反映结束后,以不照光的作空白，分别测定其他各管560nm波长下的消光度值，已知SOD活性单位以克制NT光化还原的50%为一种酶活性单位表达。按下式计算SD活性: D总活性= 式中 SD总活性以每克鲜重酶单位表达；比活力单位以酶单位mg蛋白表达;A0照光对照管的消光度值;AS样品管的消光度值；VT样液总体积（m）；V测定期样品用量（ml）;F样重（g);蛋白质浓度单位为每克鲜重含蛋白毫克数(mg/g）。用荧光灯2w照2min可以吗 不可以,二、PD、AT酶活性的测定粗酶液制备同SO。1、 过氧化物酶(POD)活性测定(愈创木酚法)（1）试剂配制：10

5、mmol/L磷酸缓冲液（6.0)：分别取母液(2HP) 61.5m和母液(NaHO ） 438.混匀即为100mlS(0.2M，pH6);（2)反映混合液配制:取50mlPBS（10mM，p6.0),加入28ul愈创木酚(2甲氧基酚）加热搅拌溶解,冷却后加入19u 30的H2O2,混匀后保存于冰箱中备用。(3）样品测定：称取1,放入预冷研钵,加适量磷酸缓冲液研磨至匀浆以4000min离心1min，上清液转入100m容量瓶，用磷酸缓冲液定容至刻度，贮于冷处备用。取试管3支,一支取反映液并加入磷酸缓冲液1ml作调零，两支取3l反映液并加入1酶液，立即计时，在470nm测定，酶隔3s读书一次。测一种

6、样加一种,不要所有加上。（边加样边测定，测定前等待秒，动作要快,如果慢的话，要保证每个样品从加好样到开始记时的时间相差不大）（4)酶活性计算:以每min D值变化（升高）0.0为1个酶活性单位(u）。POD=(47t）/（WV0.01）(u/g i）A470:为反映时间内吸光度的变化；为样品鲜重();t为反映时间（mi)；V为提取酶液总体积;Vs为测定期取用酶液体积。2、 过氧化氢酶(CAT)活性测定(1)试剂配制：0.2o磷酸缓冲液(pH.):取A母液（a2HPO4) 61.0m 和B母液(a4) 390 ml混合后至100l。（加1gVP)(2)反映液配制:吸取.68ml 0%的O2(原液

7、)稀释至00ml,摇匀即可。（3）样品测定：1.酶液提取：称取新鲜小麦叶片或其他植物组织0g置研钵中,加入2ml 4下预冷的pH7.磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后,转入5ml容量瓶中，并用缓冲液冲洗研钵多次，合并冲洗液，并定容到刻度。混合均匀将量瓶置4冰箱中静置10，取上部澄清液在400rpm下离心15i，上清液即为过氧化氢酶粗提液。4下保存备用. 2.测定：取10ml试管3支，其中2支为样品测定管，1支为空白管(加入酶液后在沸水中煮沸51min，冷却之后加入H2O2测定吸光值)，按表40-2顺序加入试剂。表40-2 紫外吸取法测定H2O2样品液配备表管 号 粗酶液() pH7.8磷酸（m

8、） 蒸馏水(l)S1 0.2 .5 1.0S . 1. .0 S3 .2 1.5 1.025预热后，逐管加入03l 01ml/L的2O2,每加完一管立即记时，并迅速倒入石英比色杯中，2nm下测定吸光度，每隔m读数1次，共测min，待支管所有测定完后,按下式计算酶活性。调零用磷酸缓冲液(pH=7.）3.成果计算: 以1in内2减少01的酶量为个酶活单位（u)。 过氧化氢酶活性（u/g/min)= A24Vt/.1V1FW式中 A240 S0 （A1+2)/ AS0加入煮死酶液的对照管吸光值; AS, AS2样品管吸光值； 粗酶提取液总体积（ml）; V测定用粗酶液体积（ml）;W样品鲜重（g)；

9、0A40每下降.1为1个酶活单位（）; t加过氧化氢到最后一次读数时间（min)五、丙二醛含量的测定1、试剂配制:10%TCA:100g 三氯乙酸 1L0.%A：.6g硫代巴比妥酸 ,加少量氢氧化钠(1mll)溶解 用0%CA定容100l(避光)ml/氢氧化钠;称gO用蒸馏水溶解定容1ml3、 测定环节:称取剪碎的试材g，加入2ml 10TC和少量石英砂,研磨至匀浆，再加8ml T进一步研磨,匀浆离心（4000r）离心10mn，上清液为样品提取液。3.显色反映和测定吸取离心的上清液2l（对照加2ml蒸馏水)，加入2ml.6TBA溶液，混匀物于沸水浴上反映1min,迅速冷却后再离心。取上清液测定

10、532nm、00nm和450n波长下的消光度。(2)双组分分光光度法按公式可直接求得植物样品提取液中DA的浓度。用上述任一措施求得MD的浓度，根据植物组织的重量计算测定样品中MD的含量：MDA(ol/gF）C2(umlL）=6.5*(D5-600)-.5*D450为MA的浓度；D450、D532、00分别代表450m、53n和600nm波长下的消光度值。七、可溶性蛋白含量的测定(考马斯亮蓝染色法)1、试剂的配制（1)考马斯亮蓝溶液配制:称取00g考马斯亮蓝,溶于50 m 90乙醇中,加入100ml 8%（W/)的磷酸（不懂）,85是磷酸的质量分数,买回来时直接就是5的磷酸,加入100ml就行。

11、再用蒸馏水定容到L,贮放在棕色瓶中，此溶液在常温下可放置1个月。(2)10/l牛血清蛋白（B）原则溶液：称取2m BSA加水溶解后定容至100 ml,再从中吸取40l用蒸馏水定容至10 ml（也可取10mg BS定容至0m即为10/l原则BS溶液）。2、样品可溶性蛋白含量的测定(）样品可溶性蛋白含量测定：称取鲜样0.5, 用m蒸馏水或磷酸缓冲液研磨提取。吸取样品提取液10Ml,放入具塞试管中(每个样品设立两个反复)，加入5Ml考马斯亮蓝G50溶液,充足混合,放置2M后在595nM下比色，记录吸光值,并通过原则曲线查得蛋白质含量。调零管是用蒸馏水样品中蛋白质的含量（Mgg)=CVT/(V1F100)(2)式中:查原则曲线值(g);V:提取液总体积(M)；:样品鲜重(); 1:测定期加样量(l)。我就测这五个因此帮下我谢谢。