液质联用技术的原理与应用-(2)

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1、质谱法及其联用技术的质谱法及其联用技术的原理与应用原理与应用 解题解题n质谱法质谱法（MassSpectrometry,MS）有机/无机/生物/同位素MS 质谱仪可直接进样n常见常见仪器分析技术仪器分析技术 液相色谱法（LC）气相色谱法（GC）毛细管电泳法 感耦等离子体（ICP）原子发射光谱法 解题解题n为何要联用？为何要联用？以LC-MS为例：LC的色谱分离MS的质谱分离（m/z分离）两个维度依次分离，是乘法，非加法！结合了LC和MS二者的优点n辨证地看待辨证地看待“联用联用”仪器的小型化、微型化，如waters公司的Qda检测器；ICP-MS。Waters公司的液质联用仪公司的液质联用仪Q

2、qQQTOFSciex公司的质谱仪公司的质谱仪QTRAPQTOFQqQOrbitrapThermoFisher公司的液质联用仪公司的液质联用仪Agilent公司的质谱联用仪公司的质谱联用仪ICP-QqQ质谱仪质谱仪GC-QqQ质谱仪质谱仪用途和优点用途和优点以LC-QqQ-MS定性、定量最常用的多反应监测（MultipleReactionMonitoring，MRM）模式为例n灵敏度高灵敏度高准确地说信噪比高LC：g/mL（ppm）LC-MS：ng/mL（ppb）、pg/mL（ppt）n特异性好特异性好干扰小，定性准确 降低了对样品前处理的要求 是公认是公认的的确证确证分析技术！分析技术！低分

3、辨率质谱仪低分辨率质谱仪用途和优点用途和优点以QTOF和Q-Orbitrap为代表：n质量准确度高（m/z精确到小数点后3-5位）n定性筛查的利器：半未知、全未知化合物 如：北京CDC高分辨率质谱仪高分辨率质谱仪从历史谈起从历史谈起n离子源离子源和和质量分析器质量分析器有多种不同的类型有多种不同的类型n以两大主线介绍以两大主线介绍质谱仪质谱仪的发展史的发展史进样系统离子源（使分析物电离）离子光学系统质量分析器（实现m/z分离，质谱仪通常据其命名）检测器真空系统计算机系统质谱发展史上的两位先驱质谱发展史上的两位先驱n1897年年，J.J.Thomson（汤汤 姆姆 孙孙，18561940）质谱仪

4、的雏形n1919年，年，F.W.Aston（阿斯顿，（阿斯顿，18771945）首次制成具有较高聚焦性能的质谱仪，用其成功发现了多种同位素，获1922年的诺贝尔化学奖质量分析器发展史质量分析器发展史n1917年，年，Dempster 发明扇形磁场质谱仪（扇形磁场分析器）n1934年，年，Mattauch和和Herzog1953年，年，Johnson和和Nier 分别设计出了两种双聚焦质谱仪（扇形磁场分析器 扇形电场分析器）n1946年，年，Stephens 发明飞行时间（Time-of-Flight，TOF）质谱仪n1949年，年，Hipple 发明离子回旋共振（IonCyclotronRes

5、onance，ICR）质谱仪，是首个超高分辨率质谱仪质量分析器发展史质量分析器发展史n1953年年，W.Paul（保罗，（保罗，19131993）提出四极质量分析器（QuadrupoleMassAnalyzer，QMA）和四极离子阱（QuadrupoleIonTrap，QIT）的理论，随后出现了四极质谱仪和QIT质谱仪nH.G.Dehmelt（德梅尔特，（德梅尔特，1922）对ICR质谱仪的发展作出突出贡献与Paul共享了1989年诺贝尔物理奖的一半质量分析器发展史质量分析器发展史n1977年和年和1984年年两 种 重 要 的 串 联 质 谱 仪 三 重 四 极（TripleQuadrupo

6、le，QqQ）质谱仪和QTOF质谱仪诞生n1995年和年和1998年，年，Bier等和等和Hager 分别设计出了两种线性离子阱（LinearIonTrap，LIT）n1999年年，A.Makarov（1966）全新概念的分析器轨道阱（Orbitrap）离子源发展史离子源发展史n气体放电气体放电电离、电离、火花火花电离、电离、辉光放电辉光放电电离电离、热热电离电离 最出现的电离技术，属于无机电离技术n1918年年，A.J.Dempster 发明电子电离（ElectronIonization，EI）最早的有机电离技术，至今仍广泛使用n1954年，年，Inghram和和Gomer 场电离，最早的“

7、软”电离技术n1966年，年，Munson和和Field 发明化学电离（ChemicalIonization，CI）离子源发展史离子源发展史n1969年，年，Beckey场解吸，打开了MS用于生物大分子分析的大门n1980s，Fenn（芬恩，（芬恩，19172010）使电喷雾电离（ElectrosprayIonization，ESI）取得重 大突破n1973年，年，Horning大气压化学电离（Atmospheric Pressure ChemicalIonization，APCI）n1980年，年，Houk以电感耦合等离子体（InductivelyCoupledPlasma，ICP）为离子源

8、，发明了ICP-MS，是元素分析的利器离子源发展史离子源发展史n1987年，年，Tanaka（田中耕一，（田中耕一，1959）将基质辅助激光解吸电离（Matrix-Assisted LaserDesorption/Ionization，MALDI）用于蛋白质分析；因将ESI和MALDI引入生物大分子领域的卓越贡献，Tanaka与ESI的发明者Fenn分享了2002年诺贝尔化学奖的一半MS基本原理基本原理nMS是是与与光光谱谱法法、核核磁磁共共振振波波谱谱法法并并称称的的三三大大物物质质定定性手段性手段之一之一nMSMS是是通通过过形形成成气气相相离离子子来来研研究究物物质质的的一一种种方方法法

9、，根根据据质质量量、电电荷荷、结结构构和和（或或）理理化化性性质质的的差差异异，运运用质谱仪对离子进行表征用质谱仪对离子进行表征提前是化合物能形成离子m/z分离通过质量分析器实现（电场；磁场；电场磁场）关于关于m/z的理解的理解n什么是什么是“质质”？什么是？什么是“荷荷”？n用于描述微观离子用于描述微观离子质量的质量的单位单位千克（Kg，SI单位，但单位太大）道尔顿（Dalton，Da）JohnDalton（17661844）统一原子质量单位（UnifiedAtomicMassUnit，u）1u1Da1.660538921（73）1027kg注：原子质量单位（AtomicMassUnit，a

10、mu，已废弃）关于关于m/z的理解的理解n相对相对质量质量VS绝对绝对质量质量初中化学的重要概念“相对原子质量（原子量）”相对质量单位为“1”，绝对质量单位为u、Da等相对质量与以u为单位的绝对质量在数值上相等n实际实际质量质量VS平均平均质量质量要区分“元素”和“原子”的质量。例如，原子质量是实际质量，元素质量是平均质量（考虑了同位素丰度）。n原子量（原子量（是是元素元素的质量的质量）原子原子质量质量n分子量分子量（是（是元素元素质量的加和，质量的加和，MS中不能直接运用）中不能直接运用）同位素分布同位素分布Sn的同位素分布的同位素分布同位素分布同位素分布瘦肉精（瘦肉精（C12H18Cl2N

11、2O）的同位素分布）的同位素分布同位素标记内标同位素标记内标：选择占比较少的同位素组成形式：选择占比较少的同位素组成形式质谱图质谱图n质谱图（质谱图（MassSpectrum）以离子的m/z为横坐标为横坐标，质量峰的强度为纵坐标注意：质谱图并非指MS所得图谱的总称横坐标既非保留时间，也非离子质量a、轮廓图、轮廓图b、棒图、棒图提取离子色谱图提取离子色谱图n质谱仪直接采集得到的是质谱图，经计算机加工得到色谱图n质谱图是色谱图的基本组成单元分辨率分辨率n分辨率（Resolution，R）反映的是相邻质谱峰的分离程度n目前最常用的定义是“半峰全宽（FullWidthatHalfMaximum，FWH

12、M）定义”分辨率分辨率n低分辨率：R1000中分辨率：R100010000高分辨率：R10000100000超高分辨率：R100000nQMA是低分辨率，TOF和Orbitrap是（超）高分辨率n通常，QMA的质谱峰的半峰宽为0.7质量准确度质量准确度n准确质量（AccurateMass）：实测值精确质量（ExactMass）：理论值质量准确度：二者的误差n分辨率会影响质量准确度nQMA的质量准确度一般为0.1u质谱仪简介质谱仪简介nSCIEX的QqQ和QTRAPTMnThermoFisher的OrbitrapnSCIEX、Waters、Bruker的QTOFnBruker的FT-ICR价格价

13、格nGC-MSnQ：80万nQqQ：120万nLC-MSnQqQ：220330万nQTOF：300400万nQ-Orbitrap：400600万nICP-MSnQ：100150万nQqQ：200250万质谱仪硬件组成质谱仪硬件组成n进样系统进样系统直接进样（如注射泵）、色谱仪等n离子源离子源n离子光学离子光学系统系统冷却、聚焦、准直等n质量质量分析器分析器n检测器检测器电子倍增器、微通道板等n真空系统真空系统为何需要保持真空？为何通常需要待机？需要液氮，是否矛盾？n计算机系统计算机系统离子源离子源n离子源是离子源是使样品使样品分子分子、原子原子或或自由基自由基转变为转变为气相离子气相离子的器件

14、，是质谱仪的的器件，是质谱仪的“门户门户”n有机有机MS中几种常见的离子源中几种常见的离子源n电子电离电子电离（ElectronIonization，EI）源源n化学电离（化学电离（CI）源）源较“软”电离；需要试剂气；适合GCn大气压电离大气压电离（AtmosphericPressureIonization，API）源源n基质基质辅助激光解吸电离辅助激光解吸电离（MALDI）源源适合蛋白质分析n无机无机MS中几种常见的中几种常见的离子源离子源 感耦等离子体感耦等离子体（InductivelyCoupledPlasma，ICP）源源EI源源n曾称为“电子轰击（ElectronImpact，EI

15、）”电离源特点特点n“硬硬”电离电离 分子离子、碎片离子；分子离子、碎片离子；多用于一级多用于一级MSn质谱图重复性好质谱图重复性好API源源n顾名思义，顾名思义，API是在是在大气压大气压而非高（如而非高（如EI）或）或低（如低（如CI）真空环境中实现的一类电离技术）真空环境中实现的一类电离技术nAPI源的出现，解源的出现，解决决了色谱仪与质谱仪接口的了色谱仪与质谱仪接口的难题难题，极大地推动了，极大地推动了LC-MS的成熟的成熟API源源n主要包括主要包括以下以下3种种类型类型电喷雾电离（E Electrolectros sprayprayI Ionizationonization，ESI

16、ESI）源大气压化学电离（AtmosphericPressureChemicalIonization，APCI）源大气压光电离（AtmosphericPressurePhotoionization，APPI）源ESI源源SCIEX公司的公司的ESI源源ESI源源Waters公司的公司的ESI源（源（Z-Spray）ESI源源Agilent公司的公司的ESI源源ESI的机理的机理n电离电离过程过程大致可分成大致可分成三个三个阶段阶段（以（以ESI为例为例）：）：n第一第一阶段阶段：使使溶液分散成溶液分散成带电带电雾滴雾滴强电场液滴形成泰勒锥瑞利稳定极限锥喷流（Cone-Jet）约1mm后就迅速膨

17、胀为羽流（Plume），即多个带正电荷的直径为12m的雾滴（高压静电气动辅助）ESI的机理的机理锥喷流的照片锥喷流的照片ESI的机理的机理n第二阶段是溶剂蒸发与第二阶段是溶剂蒸发与雾滴雾滴-喷流分裂喷流分裂（Droplet-JetFission）溶剂蒸发雾滴缩小电荷密度增加当达到瑞利稳定极限时 遂发生“雾滴-喷流分裂”循环往复体积越来越小ESI的机理的机理n第三阶段是产生第三阶段是产生气相离子气相离子，即离子从溶液中转移出，即离子从溶液中转移出来以气态来以气态存在存在n离子离子蒸发模型（蒸发模型（IonEvaporationModel，IEM）当雾滴半径达nm级时，高挥发性的离子聚集在雾滴表面

18、，在强电场作用下发生场辅助蒸发，直接从雾滴中“弹出”，成为气相离子。n带电带电残渣模型（残渣模型（ChargedResidueModel，CRM）该模型认为只有雾滴中的溶剂完全蒸发时，化合物才能继承多电荷形成一个气相离子。n两种模型均有实验支持。两种模型均有实验支持。一般一般认为，小认为，小分子化合物可用分子化合物可用IEM解释，大分子化合物解释，大分子化合物则则用用CRM解释解释ESI的特点的特点n在在大气压大气压下进行下进行对比：对比：EI在真空状态下进行n“软软”电离电离形成离子：形成离子：加合离子MH、MNa、MNH4、MCl等；去质子化分子MH 对比对比：EI是“硬”电离n单电荷与多

19、电离离子单电荷与多电离离子小分子以单电荷离子为主，大分子以多电荷离子为主n基质效应基质效应可能存在基质增强或抑制如何判断是否存在？解决办法？（同位素标记内标、基质加标、改进样品前处理）质量分析器质量分析器n1.四极质量分析器（四极质量分析器（QMA）定性、定量的利器；灵敏、特异，线性范围宽n2.四极离子阱（四极离子阱（QIT）捕获离子；可实现多级质谱法；定性能力强，定量能力不及QMAn3.线性离子阱（线性离子阱（LIT）离子容量比QIT大，许多性能优于QIT；有2种类型，其中一种为QTRAPTM（Q-LIT）注：以上3种质量分析器有共同的理论基础Mathieu（马蒂厄）方程质量分析器质量分析器

20、n4.飞行飞行时间（时间（TOF）质量）质量分析器分析器高分辨率（高质量准确度）；（半）未知物筛查n5.轨道轨道阱（阱（Orbitrap）超高分辨率（高质量准确度）；（半）未知物筛查n6.扇形磁场扇形磁场分析器分析器n7.扇形扇形电场电场分析器分析器不能单独组成质谱仪；与扇形磁场分析器组成双聚焦分析器（最早出现的分析器之一，辉煌的时代已成过去时）n8.离子离子回旋共振离子阱（回旋共振离子阱（ICR-IT）超高分辨率（高质量准确度）；价格十分昂贵四极质量分析器四极质量分析器U是直流（是直流（DC）电压）电压V是射频（是射频（RF）电压）电压理论基础理论基础Mathieu方程方程n由 法 国 数

21、学 家.Mathieu（马 蒂 厄，18351890）于1868年提出，最初是为了解决椭圆形鼓膜的横向振动一类的问题，后来发现可用来描述离子在四极场中的运动轨迹及稳定运动的条件运动方程运动方程Orbitrap（轨道阱）（轨道阱）TOF串联质谱仪和多级质谱仪串联质谱仪和多级质谱仪n由两个及以上的质量分析器串联组成由两个及以上的质量分析器串联组成n碰撞碰撞池是连接各质量分析器的桥梁池是连接各质量分析器的桥梁n单一型单一型QqQ、QqQqQ、TOF-TOFn杂交杂交型型Q-LIT、QTOF、Q-Orbitrap、LIT-Orbitrap、QIT-TOFQqQ和和Q-LIT质谱仪质谱仪nQqQ（QoQ

22、、QhQ）h表示六极杆（Hexapole）、o表示八极杆（Octopole）n碰撞碰撞池池仅加RF电压；小写q以示区别碰撞气（以N2居多）QqQ和和Q-LIT质谱仪质谱仪QTRAP系列系列串联质谱法和多级质谱法串联质谱法和多级质谱法n串联质谱法（串联质谱法（MS/MS，MS2）和）和多级质谱法多级质谱法（MSn）先驱离子（母离子、前体离子）和产物离子（子离子、孙离子、第n代产物离子）是相对而言的m1m2m3m4m5n空间MS/MS和MSn在串联质谱仪和多级质谱仪上实现n时间MS/MS和MSn通过不断增加分析器个数来增加MS的级数毕竟是不现实的不需要串联质谱仪和多级质谱仪QIT、LIT和ICR等

23、离子阱类质谱仪单级单级MS扫描模式扫描模式n以四极质谱仪为例：以四极质谱仪为例：nQ1全扫描（全扫描（Q1FullScan）Q1选择一段m/z范围的离子通过，q2、Q3全通过用于需找未知化合物；目标化合物的方法开发nQ3全全扫描扫描（Q3FullScan）Q1、q2全通过，Q3选择一段m/z范围的离子通过单级单级MS扫描模式扫描模式n选择离子监测（选择离子监测（SelectedIonMonitoring，SIM）Q1选择一个特定m/z的离子通过，q2、Q3全通过或者，Q1、q2全通过，Q3选择一个特定m/z的离子通过目标化合物的定性、定量分析信噪比比全扫描更高GC-MS最常用的扫描模式MS/M

24、S扫描模式扫描模式n多多反反应应监监测测（MultipleReactionMonitoring，MRM）又称为“选择反应监测（SelectedReactionMonitoring，SRM）”“反应”指的是碰撞反应MRM是QqQ最主要的工作模式，用于定量分析MS/MS扫描模式扫描模式nMRM模式下，每一化合物选择模式下，每一化合物选择2组组离子对即可确证离子对即可确证CommissionDecisionof12August2002:ImplementingCouncilDirective96/23/EC Concerning the Performance of Analytical Metho

25、ds and theInterpretationofResults(2002/657/EC).OffJEurCommunities，2002，L221：8.MS/MS扫描模式扫描模式n产物离子扫描（ProductIonScan）与MRM不同的是，Q3是选择一段m/z范围的离子通过n 进一步增加定性的可靠性食品安全风险监测食品安全风险监测n食源性食源性疾病疾病、食品、食品污染污染以及食品中以及食品中有害有害因素（物因素（物理、化学、生物因素）理、化学、生物因素）食品安全风险监测食品安全风险监测食品安全风险监测食品安全风险监测食品安全风险监测食品安全风险监测真菌毒素（真菌毒素（DONs和和ZON）

26、真菌毒素（真菌毒素（DONs和和ZON）化合物化合物母离子（母离子（m/z）子离子（子离子（m/z）所用内标所用内标DON295.1264.9*13C15-DON138.13-ADON337.1307.1*13C15-DON173.115-ADON337.1150.1*13C15-DON219.0ZON317.2175.013C18-ZON273.213C15-DON310.1279.0*144.913C18-ZON335.3185.2*290.2*定量离子。定量离子。真菌毒素（真菌毒素（DONs和和ZON）硝基呋喃代谢物硝基呋喃代谢物硝基呋喃代谢物硝基呋喃代谢物n样品匀浆加入10mL甲醇-水

27、（1:1）振荡提取弃去液体加10mL0.2mol/L盐酸均质加入混合内标标准溶液、邻硝基苯甲醛溶液置37恒温箱中过夜加1mL0.3mol/L磷酸钾氢氧化钠调pH7.4分别加入10mL乙酸乙酯提取两次收集乙酸乙酯层氮吹残渣用1mL0.1%甲酸溶解再用3mL乙腈饱和的正己烷分两次液液分配下层水相过0.2m微孔滤膜取10L供仪器测定硝基呋喃代谢物硝基呋喃代谢物化合物化合物母离子（母离子（m/z）子离子（子离子（m/z）2-NP-AOZ236.2134.1*104.22-NP-AMOZ335.2291.2*262.32-NP-AHD249.2133.8*104.12-NP-SEM209.2166.2*

28、192.22-NP-D4-AOZ240.1134.0*2-NP-D5-AMOZ340.1296.0*2-NP-13C3-AHD252.1134.0*2-NP-13C15N2-SEM212.1168.0*生活饮用水分析生活饮用水分析n灭草松和2,4-滴是两种常见的除草剂。nLC由于紫外检测的灵敏度较低，需取大体积水样进行浓缩，否则不能满足卫生标准的检出要求GB/T5750-2006生活饮用水标准检验方法采用GC，水样需先经液液萃取，浓缩后再甲基化衍生，操作步骤较为繁琐 灭草松灭草松2,4-滴滴生活饮用水分析生活饮用水分析化合物化合物前体离子（前体离子（m/z）产物离子（产物离子（m/z）灭草松灭

29、草松238.7132.0*175.1196.92,4-滴滴221.0160.8*162.8n水样水样0.45m滤膜过滤滤膜过滤直接进样分析直接进样分析n基质加标工作曲线基质加标工作曲线生活饮用水分析生活饮用水分析生活饮用水分析生活饮用水分析化合物化合物检出限检出限（mg/L）卫生限量卫生限量（mg/L）灭草松灭草松0.00040.32,4-滴滴0.00060.03仪器安装的环境条件仪器安装的环境条件n温度、湿度温度、湿度高分辨率质谱仪要求更严；仪器和操作者在不同的隔高分辨率质谱仪要求更严；仪器和操作者在不同的隔离空间；离空间；n排风、补风排风、补风n废弃排放废弃排放n电压、电流电压、电流n氮气氮气/零级发生器（噪音、电压、通风）零级发生器（噪音、电压、通风）谢谢！谢谢！