kras和egfr检测与临床应用

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1、KRAS和 EGFR检测与临床应用 汇报内容 KRAS和 EGFR的简介及临床意义 ARMS-PCR的基本原理和技术特点 等位特异性引物设计 KRAS试剂盒开发简介 KRAS和 EGFR的简介及临床意义 KRAS背景 KRAS是一种原癌基因，长约 35kb，位于 12号染色体，是 RAS基因 家族成员之一，编码的蛋白主要参与 PI3K、 PTEN、 AKT和 RAF、 MEK、 ERK信号通路的调控； EGFR在通路中位于 KRAS上游，配体与之结合后可以激发其酪氨酸 激酶活性，导致 KRAS的活化和通路中信号传导； KRAS是许多恶性肿瘤的常见突变基因：胰腺癌（ 65%-90%）、结直 肠癌

2、（ 40%）、肺癌（ 20%）、卵巢癌（ 15%）。 KRAS基因突变影响结直肠癌药物疗效 KRAS基因野生型的转移性结直肠癌患者能从 EGF抗体（ 西妥昔单抗 、帕尼单抗 ）治疗中获益，而基因突变的患者治疗效果很差； KRAS突变型患者对西妥昔单抗无应答，其总体生存期明显低于 KRAS野生型患者 Karapetis CS, 2008, N Eng J Med 结直肠癌患者检测 KRAS突变相关指南 欧洲药品评估局（ EMEA， 2008）指出： KRAS野生型的进展期结直肠癌患者可能从 帕尼单抗中受益，而突变型患者受益较少。 美国临床肿瘤学会（ ASCO， 2009）推荐： 转移性结直肠癌患

3、者应检测 KRAS突变， 如有 KRAS12、 13位突变，则不应进行 EGFR单克隆抗体治疗； 美国 FDA指南推荐：在使用靶向药物西妥昔单抗和帕尼单抗治疗转移性结肠直肠癌前 必须检测 KRAS基因的基因型； 2012年 7月 6日批准第一个用于结直肠癌的基因检测（ Qiagen） ，以判断西妥昔单抗是否有效； 美国国立综合癌症网络（ NCCN， 2014）指南说： 转移性结直肠癌患者均应进行 RAS 突变检测（ KRAS和 NRAS），至少应检测 KRAS第二外显子的突变情况 。 KRAS或 NRAS突变型的病人不应采取西妥昔单抗或帕尼单抗治疗。 中国卫生部于 2010年 10月 14日发

4、表了结直肠癌诊疗规范（ 2010版） 。明确指出 在患者确定为复发或转移性结直肠癌接受 西妥昔单抗 、帕尼单抗时，必须检测肿瘤组 织的 K-ras基因状态。在晚期 /转移性结直肠癌化疗中，在治疗前检测肿瘤 K-ras 基因 状态， EGFR不推荐作为常规检查项目。 KRAS基因突变影响非小细胞肺癌 药物疗效 KRAS基因野生型的非小细胞肺癌患者能从小分子酪氨酸激酶抑制剂（ TKI，如 吉 非替尼、厄洛替尼 ）治疗中获益，而基因突变的患者易发生抵抗； KRAS突变型患者使用厄洛替尼联合化疗后，其无症状生存期和总生存期明显低于野生型患者（图中 红线所示） Anderson SM, 2011, Ex

5、pert Rev. Mol. Diagn Eberhard DA, 2005, J Clin Oncol 非小细胞肺癌患者检测 KRAS突变 相关指南 美国国立综合癌症网络（ NCCN， 2009）指出， KRAS突变与非小细 胞肺癌患者 TKI抵抗有关， KRAS基因测序有助于确定哪些病人适合 TKI治疗。 当 KRAS基因发生了突变，则不建议病人使用厄洛替尼进 行分子靶向治疗。 KRAS主要突变位点 在结直肠癌中， KRAS突变主要发生于 codon12 (80%)、 codon13 (15-20%)、 codon61和 146 (C 6239 G719S 18 2155GA 6252 G

6、719C 18 2155GT 6253 E746-A750del(1) 19 2235-2249del15 6223 E746-A750del(2) 19 2236-2250del15 6225 L747-P753S 19 2240-2257del18 12370 E746-A750I 19 2235-2252AAT(complex) 13551 E746-A750del 19 2235-2253del18 12728 E746-A750A 19 2237-2251 del15 12678 E746-S752A 19 2237-2254 del18 12367 E746-S752V 19 22

7、37-2250 T(complex) 12384 E746-S752D 19 2238-2255 del18 6220 L747-A750P 19 2238-2248 GC(complex) 12422 L747-T751Q 19 2238-2252 GCA(complex) 12419 L747-E749del 19 2239-2247del9 6218 L747-T751del 19 2239-2253del15 6254 L747-S752del 19 2239-2256del18 6255 L747-A750P 19 2239-2248TTAAGAGAAG C 12382 L747-P

8、753Q 19 2239-2258CA(complex) 12387 L747-T751S 19 2240-2251del12 6210 L747-T751del 19 2240-2254del15 12369 L747-T751P 19 2239-2251 C(complex) 12383 T790M 20 2369C T 6240 S768I 20 2303GT 6241 V769-D770insASV 20 2307-2308 ins GCCAGCGTG 12376 H773-V774insH 20 2319-2320 ins CAC 12377 D770-N771insG 20 231

9、0-2311 ins GGT 12378 L858R 21 2573TG 6224 L861Q 21 2582TA 6213 EGFR突变与 EGFR-TKI药物疗效关 系 所在外显子 突变类型 与 EGFR-TKI疗效关系 18 G719A(S/C)3种点突变 药敏突变 19 19种缺失突变 药敏突变 20 点突变 S768I 药敏突变 20 点突变 T790M 耐药突变 * 20 3种插入突变 耐药突变 * 21 点突变 L858R 药敏突变 21 点突变 L861Q 药敏突变 ADx EGFR试剂盒突变结果检测 组别 突变类型 所占比例 对吉非替尼 敏感性 证据 1 Exon 19 de

10、letions; L858R 90% 充分 2 T790M/deletion; T790M/L858R; G719X; L861Q; S768I 7% 有限 3 T790M alone; Exon 20 insertions; other mutations 3% 无 ARMS-PCR的基本原理和技术特点 ARMS-PCR原理 ARMS是 Amplification Refractory Mutation System (扩增阻碍突 变系统 )的缩写。 根据 PCR过程中要求引物和模板间的严格互补配对来实现对突变位 点的检测 , 当引物 3 末端出现错配时 , 产物将不能延伸。 因此设计两条上

11、游（或下游）引物， 使其 3末端分别与突变位点碱基 匹配和错配 ，共用下游（或上游）引物，分别扩增野生型和突变型目 的片断。 ARMS-PCR原理 Two Allele-Specific (AS) primers, one for each allele of a SNP are designed. The AS primers contain one of two polymorphic nucleotides at the primer 3 end. Two sets of primers, either forward or reverse primers can be designed

12、. If a common reverse or forward primer is used in a PCR reaction, the reaction is called allele-specific PCR (AS-PCR). You F. M. 2008, BMC Bioinformatics PCR产物检测 -Real time PCR 每个 PCR循环 检测荧光信号 ， 不同 PCR产物，不同荧光信号 相比凝胶电泳：更快，可定量，无 PCR产物污染 信号产生方法： Scorpion (Qiagen)，双环探针 (厦门艾德 )， Taqman ， Molecular beaco

13、ns， Sybr green， Yo-pro Figure 2 The sensitivity of QuanTAS- PCR for quantifying JAK2 mutant alleles. Zapparoli G. V. 2013, BMC Cancer 应用于 Real time-PCR的 ARMS-PCR G C A T G A A G G allele A allele 5 5 5 5 3 3 3 3 AS primer AS primer Mismatch Mismatch Reverse primer Reverse primer FAM-5 3-BHQ1 FAM-5 3

14、-BHQ1 Probe Probe ARMS技术特点 优点： 灵敏度高 （ 0.1-1%） 操作简便 周期短 不产生 PCR产物污染 适用样本类型多 （如 FFPE） 精确突变类型 缺点： 方法建立需时较长 仅能检测已知突变 测序法与 ARMS法相比较 Sanger测序法 焦磷酸测序 ARMS 敏感度 10-20% 5-10% 1% FFPE标本成功率 低 较高 高 商用试剂盒 无 有 有 流程与速度 1-2天 2-3天 AGT Gly13Ser GGCAGC Gly12Arg GGTCGT Gly13Arg GGCCGC Gly12Cys GGTTGT Gly13Cys GGCTGC Gly

15、12Asp GGTGAT Gly13Asp GGCGAC Gly12Ala GGTGCT Gly13Ala GGCGCC Gly12Val GGTGTT Gly13Val GGCGTC 三引物设计原理 You F. M. 2008, BMC Bioinformatics 三引物设计 ATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTA GGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTG TGGACGAATATGATCCAACAATAGAGGATTCCTACAGGAAGC AAGTAGTAATTGATGGAGAAACCTGTCT

16、CTTGGATATTCTCGA CACAGCAGGTCAAGAG 野生型引物（ F） 5-CTTGTGGTAGTTGGAGCTG-3 19nt， 51 突变型引物（ F） 5-CTTGTGGTAGTTGGAGCTA-3 19nt， 49 下游引物（ R） 5-CCTCTATTGTTGGATCATATTCGTC-3 25nt， 54 三引物设计 下游引物设计 ATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTA GGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTT GTGGACGAATATGATCCAACAATAGAGGATTCCT

17、ACAGGAAG CAAGTAGTAATTGATGGAGAAACCTGTCTCTTGGATATTCTCG ACACAGCAGGTCAAGAG 选择序列 ： 5-GACGAATATGATCCAACAATAGAGG-3 互补链： 3- CTGCTTATACTAGGTTGTTATCTCC-5 下游引物： 5- CCTCTATTGTTGGATCATATTCGTC -3 3端增加错配 如果 3端是弱错配（ C/A或 G/T）则需要引入强的错配（ A/G或 C/T） 才可阻断 3端的扩增； 如果 3端是强错配（ A/G或 C/T）则需要引入弱的错配（ C/A或 G/T） 或不需引入错配即可阻断 3端的扩增

18、； 当 3端是中度错配（ A/A， C/C， G/G 或 T/T）则需要引入中度的错配 。 野生型引物（ F） 5-CTTGTGGTAGTTGGAGCTG-3 突变型引物（ F） 5-CTTGTGGTAGTTGGAGCCT-3 下游引物（ R） 5-CCTCTATTGTTGGATCATATTCGTC-3 四引物设计 四引物设计 ATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGT AGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATT TTGTGGACGAATATGATCCAACAATAGAGGATTCCTACAGG AAGCAAGTA

19、GTAATTGATGGAGAAACCTGTCTCTTGGATATT CTCGACACAGCAGGTCAAGAG 内引物（ F） 5-CTTGTGGTAGTTGGAGCTA-3 内引物（ R） 5-ACTCTTGCCTACGCCACC-3 外引物（ F） 5-ATGACTGAATATAAACT-3 外引物（ R） 5-CTCTTGACCTGCTGTGTCG-3 KRAS试剂盒开发简介 KRAS突变探针和引物设计 KRAS序列： ATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGAT ACAGCTAATTCAGAATCATTTT

20、GTGGACGAATATGATCCAACAATAGAGGATTCCTACAGGAA GCAAGTAGTAATTGATGGAGAAACCTGTCTCTTGGATATTCTCGACACAGCAGGTCAAGAG 1. 5-CTT GTG GTA GTT GGA GCT TA-3 12GGT GAT 2. 5- AAA CTT GTG GTA GTT GGA GCG GT-3 12GGT GTT 3. 5- AA CTT GTG GTA GTT GGA GCT GC-3 12GGT GCT 4. 5- ATAAA CTT GTG GTA GTT GGA GCT A-3 12GGT AGT 5. 5-

21、 AA CTT GTG GTA GTT GGA GCG T-3 12GGT TGT 6. 5- ATAAA CTT GTG GTA GTT GGA GCC C-3 12GGT CGT 7. 5- GTG GTA GTT GGA GCT GGT AA-3 13GGC GAC 8. 参照引物： 5-CT GAA TAT AAA CTT GTG GTA GTT-3 9. 下游引物： 5-ACCTCTATTGTTGGATCATATTCGTC-3 TaqMan探针： 5-FAM-TCTGAATTAGCTGTATCGTCAAGGCACTCT-BHQ1-3 锁核酸阻滞探针 (野生型 )： 5-T GGA G

22、CT GGT GGC GTA GGC-P04-3 浙江大学， CN 102367478 B 反应体系 引物终浓度： 0.3 M Taqman探针终浓度： 0.1 M LNA阻滞探针终浓度： 0.9 M Goldstarbest Taq酶终浓度： 0.05 U/l 模板 DNA终浓度： 10-300 ng/l dNTPs终浓度： 0.2 mM MgCl2 终浓度： 3.5 mM Real time-PCR循环 : 95 C预变性 10分钟 95 C 15秒 60 C 40秒 扩增反应 40循环， 60 C 40秒 ARMS-qPCR在 ABI7500或 LC480检测仪上进行。每个样本进 行 8

23、管反应，每管反应加入共同的 qPCR混合液， LNA阻滞探针 及模板 DNA，所不同的只有参照引物或者 ARMS引物。 拟开发产品 特异性引物： 7条 （ 检验特异性 ） 参照引物： 1条 （ 检验特异性 ） 下游引物： 1条 （ 检验特异性 ） Taqman探针： 1条 锁核酸阻滞探针： 1条 阳性对照：包含 7种突变的质粒 DNA模板 （测序） Taq酶，最好为 Taq Gold （ hot start enzyme) qPCR混合反应液 结果判读 参照引物管扩增曲线阳性，各种 ARMS引物管均无扩增曲线或者其与 参照引物管的扩增曲线 Ct差值 10，该样本结果判断为野生型； 参照引物管扩增曲线阳性，相应 ARMS引物管扩增曲线阳性，且其与 参照引物管的扩增曲线 Ct差值 7，该样本结果判读为可疑突变型； 如重复检测 3次均显示扩增曲线阳性，该样本结果判读为突变型； 参照引物管扩增曲线阴性，提示该样本提取失败，需要重新提取。