图解RCR的反应原理类型应用范例

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1、PCRPCR技术及其应用技术及其应用生物化学实验技术目 录PCRPCR的反应原理的反应原理PCRPCR的类型和应用的类型和应用PCRPCR示例示例 多聚酶链式反应多聚酶链式反应（PCR：Polymerase Chain Reaction)Kary B.MullisKary B.Mullis PCR是由美国科学家是由美国科学家穆利斯提出的一种穆利斯提出的一种体外简化条件下模拟体外简化条件下模拟DNADNA体内复制的体内复制的DNADNA快速扩增的方法，此技术获得快速扩增的方法，此技术获得19931993年诺贝年诺贝尔化学奖。尔化学奖。体内体内DNADNA的复制体系的复制体系DNADNADNADN

2、A聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶（I II IIII II IIII II IIII II III）拓扑异构酶拓扑异构酶拓扑异构酶拓扑异构酶解旋酶类解旋酶类解旋酶类解旋酶类SSBSSBSSBSSB 引物引物引物引物dNTP MgdNTP MgdNTP MgdNTP Mg2+2+2+2+5 5 3 3 Mullis的的PCR构思构思引物引物引物引物DNADNA聚合酶聚合酶DNADNA聚合酶聚合酶特定特定DNADNA片段片段TaqTaq DNADNA聚合酶（聚合酶（thermus aquaticus)thermus aquaticus)酶酶酶酶活活活活性性性性(%)温度温度温度温度()40 50 60

3、70 80 90 100100 80 60 40 20耐热耐热DNADNA聚合酶聚合酶Saiki（1988）将耐热）将耐热DNA聚合酶引入聚合酶引入PCR，使利用热变性解链，使利用热变性解链DNA模板可行。模板可行。PCR反应循环反应循环7272949494945555PCRPCR循环循环循环循环变性变性变性变性退火退火退火退火延伸延伸延伸延伸 PCR PCR的指数扩增（的指数扩增（2 2n n）引物引物引物引物延伸延伸延伸延伸延伸延伸延伸延伸5 5 5 5 3 3 3 3 变性、退火变性、退火变性、退火变性、退火变性、退火变性、退火变性、退火变性、退火变性、退火变性、退火变性、退火变性、退火

4、延伸延伸延伸延伸TaqTaqP1P1P2P2PCR反应体系dATPdTTPdGTPdCTPMg2+模板：模板：DNA引物：引物：P1+P2DNA聚合酶：聚合酶：TaqE原料：原料：dNTP反应缓冲液反应缓冲液10 xBuffer辅助因子：辅助因子：Mg2+1 1）PCRPCR反应成分反应成分（1 1 1 1）模板）模板）模板）模板 单、双链单、双链DNADNA均可。均可。不能混有蛋白酶、核酸酶、不能混有蛋白酶、核酸酶、DNADNA聚合酶抑制剂、聚合酶抑制剂、DNADNA结合蛋白类。结合蛋白类。DNADNA模板一般模板一般100ng/100100ng/100 L L。模板浓度过高会导致反应的非特

5、异性增加。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。PCR反应条件（2 2 2 2）引物浓度）引物浓度）引物浓度）引物浓度 0.1-0.5 0.1-0.5 mol/Lmol/L 浓度过高易导致模板与引物错配浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。反应特异性下降。（3 3 3 3）TaqTaqTaqTaq DNADNADNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶 0.5-2.5 U/50 0.5-2.5 U/50 l l 酶量增加使反应特异性下降酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。酶量过少影响反应产量。（4 4 4 4）dNTPdNTPdNTPdNTP（10mM or 2.5mM 10mM

6、 or 2.5mM 10mM or 2.5mM 10mM or 2.5mM）含四种核苷酸含四种核苷酸dATPdATPdATPdATP、dGTPdGTPdGTPdGTP、dCTPdCTPdCTPdCTP、dTTPdTTPdTTPdTTP dNTPdNTP浓度取决于扩增片段的长度浓度取决于扩增片段的长度 浓度过高易产生错误碱基的掺入浓度过高易产生错误碱基的掺入,浓度过低则降低反浓度过低则降低反应产量应产量 dNTPdNTP可与可与MgMg2 2+结合结合,使游离的使游离的MgMg2+2+浓度下降浓度下降,影响影响DNADNA聚合酶的活性。聚合酶的活性。（5 5 5 5）Mg2+Mg2+Mg2+是是

7、DNADNA聚合酶的激活剂。浓度为。聚合酶的激活剂。浓度为。Mg2+Mg2+浓度过低会使浓度过低会使TaqTaq酶活性丧失、酶活性丧失、PCRPCR产量下降；产量下降；Mg2+Mg2+过高影响反应特异性。过高影响反应特异性。Mg2+Mg2+可与负离子结合可与负离子结合,所以反应体系中所以反应体系中dNTPdNTP、EDTAEDTA等等的浓度影响反应中游离的的浓度影响反应中游离的Mg2+Mg2+浓度。浓度。2 2 2 2）循环参数）循环参数）循环参数）循环参数(1)(1)变性变性变性变性 使双链使双链DNADNA解链为单链解链为单链 9494，30-6030-60秒秒(2)(2)(2)(2)退火

8、退火退火退火 温度由引物长度和温度由引物长度和GCGC含量决定。含量决定。增加温度能减少引物与模板的非特异性结合增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降降低温度可增加反应的灵敏性。低温度可增加反应的灵敏性。引物设计：引物设计：（1)1)序列应位于高度保守区序列应位于高度保守区,与非扩增区无同源与非扩增区无同源 序列。序列。（2 2）引物长度以）引物长度以15-40 bp15-40 bp为宜。为宜。（3 3）碱基尽可能随机分布碱基尽可能随机分布,G+C,G+C占占40-60%40-60%。（4 4）引物内部避免形成二级结构。）引物内部避免形成二级结构。（5 5）两引物间避免有互补序列。）两引物

9、间避免有互补序列。（6 6）引物）引物3 3 端为关键碱基；端为关键碱基；5 5 端无严格限制。端无严格限制。（3 3 3 3）延伸）延伸）延伸）延伸 70-75,70-75,一般为一般为7272 延伸时间由扩增片段长度决定延伸时间由扩增片段长度决定（4 4 4 4）循环次数）循环次数）循环次数）循环次数 主要取决于模版主要取决于模版DNADNA的浓度的浓度 一般为一般为25-3525-35次次 次数过多：扩增效率降低次数过多：扩增效率降低 错误掺入率增加错误掺入率增加 PCR PCR的应用的应用 1 1、特定、特定DNADNA片段（基因、调控序列）的鉴定、分离片段（基因、调控序列）的鉴定、分

10、离或制备。或制备。A A、DNA BDNA B、cDNAcDNA 2 2、基因表达分析（原位、离体）、基因表达分析（原位、离体）A A、基因是否表达、基因是否表达 B B、基因表达水平高低、基因表达水平高低 3 3、基因突变、基因突变基因克隆（）基因克隆（）逆转录酶逆转录酶聚合酶聚合酶mRNAcDNA杂交双链杂交双链PCRPCR扩增扩增1.1.细细胞胞或或组组织织固固定定：细细胞胞经经固固定定和和乙乙醇醇通通透透化化处处理理后便适于一般后便适于一般PCRPCR试剂（包括引物和试剂（包括引物和TaqTaq酶）进入酶）进入2.PCR2.PCR扩增细胞内目的片段扩增细胞内目的片段3.3.原位杂交检测

11、扩增产物原位杂交检测扩增产物A.阳性对照B.阴性对照C.原位检测mRNA表达原位分析基因表达的组织特异性原位分析基因表达的组织特异性原位分析基因表达的组织特异性原位分析基因表达的组织特异性荧光定量荧光定量荧光定量荧光定量 PCRPCRPCRPCR（real-time PCR)real-time PCR)real-time PCR)real-time PCR)分析基因表达水平分析基因表达水平分析基因表达水平分析基因表达水平 通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对对PCRPCR产物进行标记跟踪产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程实时在线监控反应过程,结合结合

12、相应的软件可以对结果进行分析相应的软件可以对结果进行分析,计算待测样品的初计算待测样品的初始模板量。始模板量。内掺式染料内掺式染料SYBR GreenSYBR Green I序列特异性探针序列特异性探针Taqman Taqman Molecular BeaconsMolecular Beacons Dual Probes(Dual Probes(FRET)FRET)引物特异性探针引物特异性探针 Amplifluor(Intergen)Amplifluor(Intergen)5353SGSGSGSGSGExcitationEmissionSYBR-Green ISYBR-Green I 反向反向

13、反向反向PCR(reverse PCR)PCR(reverse PCR)PCR(reverse PCR)PCR(reverse PCR)扩增已知序列两侧的未知序列扩增已知序列两侧的未知序列扩增已知序列两侧的未知序列扩增已知序列两侧的未知序列 用反向的互补引物来扩增两引物以外的用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNADNA片段，片段，对某个已知对某个已知DNADNA片段两侧的未知序列进行扩增。片段两侧的未知序列进行扩增。未知序列未知序列未知序列未知序列已知序列已知序列已知序列已知序列未知序列未知序列未知序列未知序列限制酶限制酶限制酶限制酶连接酶连接酶 实时荧光定量实时荧光定量PCR仪仪梯度梯度P

14、CR仪仪普通普通PCR仪仪1 1、材料：含插入片段的克隆载体、材料：含插入片段的克隆载体2 2、仪器：微量移液器及吸头、仪器：微量移液器及吸头、PCRPCR仪及仪及PCRPCR管管 琼脂糖凝胶电泳设备琼脂糖凝胶电泳设备3 3、试剂：、试剂：1010X XPCRPCR 反应缓冲液反应缓冲液 25mmol/L MgCl25mmol/L MgCl2 2 10mmol/L dNTP10mmol/L dNTP 10 10mol/L mol/L 引物引物1 1和引物和引物2 2二、实验材料、仪器和二、实验材料、仪器和试剂试剂1.1.反应体系（反应体系（5050l l体系）：体系）：10 X PCR反应缓冲

15、液反应缓冲液 25mmol/L MgCl2 10mmol/L dNTP 10mol/L 引物引物1 10mol/L引物引物2 模板模板DNA TaqE 补充水补充水 三、操作步骤三、操作步骤10 X B10 X P1 P210 X T10 X E 2.2.按照如下体积向按照如下体积向PCRPCR管中按顺序加入各试剂管中按顺序加入各试剂 并混匀：并混匀：三、操作步骤三、操作步骤10 X Buffer 2.5 L10 X P1 2.5 L10X T 2.5 L10 X E 2.5 L25 L水水 12.5 L10 X P2 2.5 L扩增程序：扩增程序：9494 5-10min（预变性）（预变性）

16、94 30S 55 30S 72 30S 72 5-10min（后延伸）（后延伸）4 保温保温30Cycles屏幕显示方式屏幕显示方式MainRun Enter List Edit File Lid运行已运行已有程序有程序已有程已有程序菜单序菜单删除已删除已有程序有程序新建反新建反应程序应程序编辑已编辑已有程序有程序热盖关热盖关闭调节闭调节EnterEnter abcdefghi#jklmnopqr#Name#stuvwxyz#In Use!.,-+/():=#Enter PCR1Control MethodBLOCK Sim-Tube输入文件名输入文件名,满满8个字个字符自动生成程序名符自动

17、生成程序名,不不满满8个字符时用个字符时用#终止终止BLOCK:屏幕显示样品台屏幕显示样品台温度温度(样品台温控方式样品台温控方式)Sim-Tube:屏幕显示反应屏幕显示反应液温度液温度(模拟管温控方式模拟管温控方式)Enter PCR1Segment#1 Hold Cycle END选择预变性保温选择预变性保温循环内第一步温度和时间循环内第一步温度和时间Enter PCR1Hold at 94CHold for 5m0s预变性温度和时间预变性温度和时间Enter PCR1Segment#2Hold Cycle END 3 step PCR循环参数设置循环参数设置Step#194.0C Hol

18、d 0m30s循环内步骤数循环内步骤数Step#1Option？No yes不需要拓展功能不需要拓展功能Step#255.0C Hold 0m40s循环内第二步温度和时间循环内第二步温度和时间Step#2Option？No yes不需要拓展功能不需要拓展功能Step#372.0C Hold 0m30s循环内第三步温度和时间循环内第三步温度和时间不需要拓展功能不需要拓展功能设置循环数设置循环数后延伸保温后延伸保温后延伸温度和时间后延伸温度和时间Step#3Option？No yesTotal Cycle=35Segment#3Hold Cycle ENDHold at 72.0CHold for

19、 10m0sSegment#4Hold Cycle END选择反应完后保温选择反应完后保温Hold at 4.0CHold for 99m0s设置反应完后的保温温度设置反应完后的保温温度和时间和时间Segment#5Hold Cycle END终止参数设置终止参数设置Enter PCR1Estimated Run Time：1h53m05sSave？YES no预计反应时间，程序是否预计反应时间，程序是否保存保存LidLIDTurn off heatedLid below 9C当当温温度度低低于于9度度时时，热盖自动关闭热盖自动关闭RunPCR1 PCR2RUN PCR1Use heated lid?Yes NoRUN PCR1Vessel:0.2TUBE0.5tube plateRUN PCR1Volume(Ul)50 KRUN PCR1Lid temperature:19 4.4.反应完成后反应完成后,将反应液与凝胶电泳缓冲液按将反应液与凝胶电泳缓冲液按比例混匀比例混匀,上样电泳。上样电泳。三、操作步骤三、操作步骤The End！