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1、 （ 1） 酵母菌的形态观察 及死活细胞的鉴别 （ 2）酵母菌子囊孢子的观察 实验八 一、目的要求 1. 观察酵母菌的细胞形态及出芽生殖方式 。 2.学习掌握区分酵母菌死 、 活细胞的实验方法 。 3. 掌握酵母菌的一般形态特征及其与细菌的区别。 4.学习并掌握酵母菌子囊孢子的观察方法。 二、基本原理 酵母菌形态 酵母菌是多形的 、 不运动的单细胞真核微生物 ， 细 胞核与细胞质已有明显的分化 ， 菌体比细菌大 。 繁 殖方式也较复杂 ， 无性繁殖主要是 出芽生殖 ， 仅裂 殖酵母属是以分裂方式繁殖；有性繁殖是通过接合 产生子囊孢子 。 本实验通过用 美蓝染色浸片 来观察 生活的酵母形态和出芽
2、生殖方式 。 二、基本原理 美蓝染色液 美蓝为无毒性染料，其氧化型为蓝色，而还原型为无色。用 它对酵母菌染色时，由于活细胞的新陈代谢作用，使细胞内 具有较强的还原能力，能使美蓝从蓝色的氧化型变为无色的 还原型，所以酵母的活细胞无色；对于死细胞或代谢缓慢的 老细胞，则因它们无此还原能力或还原能力极弱，而被美蓝 染成蓝色或淡蓝色。因此，用美蓝水浸片不仅可观察酵母的 形态，还可以区分死、活细胞。 美蓝（氧化型） 蓝色 美蓝（还原型） 无色 还原剂 氧化剂 二、基本原理 死活细胞鉴别原理 美蓝（氧化型） 蓝色 美蓝（还原型） 无色 酵母活细胞 新陈代谢 还原能力 子囊孢子是子囊菌类真菌有性生殖产生的有
3、性 孢子。在酵母菌中，能否形成子囊孢子及其形 态是酵母菌分类鉴定的重要依据之一。酵母菌 形成子囊孢子需要一定的条件，所以对不同种 属的酵母要选择适合形成子囊孢子的培养基。 麦氏 (McClary) 培养基 ( 葡萄糖醋酸钠培养 基 ) 有利于酿酒酵母子囊孢子的形成。 二、基本原理 子囊孢子观察 三、实验器材 1.菌种： 酿酒酵母 （ Saccharomyces cerevisiae) 2.溶液与试剂： 0.1% 吕氏碱性美蓝染液 ， 5%孔雀 绿 ， 0.5%沙黄 、 95%乙醇 3. 培养基： 麦芽汁琼脂斜面 ， 麦氏琼脂斜面 。 4. 仪器或其他用具： 显微镜 ， 载玻片 ， 盖玻片酒 精
4、灯 、 接种环等 。 四、操作步骤 美兰染色 在载玻片中央加一滴吕氏碱性美蓝染色液，用接种环挑取少 量酵母菌苔，混合均匀； （注：染液不宜过多或过少） 用镊子取一块盖玻片，先将一边与菌液接触，然后慢慢将盖玻 片放下使其盖在菌液上；（ 注：盖玻片不宜平着放下） 将制片放置约 3min，先低倍镜后高倍镜观察酵母形态和出芽 情况，并根据颜色区别死活细胞。 染色 30min后再次观察，注意死活细胞数量的变化； 用其它浓度的吕氏碱性美蓝染色液重复上述操作。 四、操作步骤 子囊孢子观察 1.菌种活化： 将酿 酒酵母 移种至新鲜的麦芽汁琼脂斜面上， 2528 度 培养 24h左右，然后再转种 23次。 （注
5、：麦芽汁 斜面培养基需用新配制、表面湿润的。） 2. 产孢培养： 将经活化的菌种转接到麦氏琼脂斜面上， 2528度培养约一周。 3. 制片： 取经产孢培养的酵母斜面培养物，在洁净载玻片上 按常规涂片、干燥、固定。 4. 染色： 滴加孔雀绿染液染色 1min。 5. 脱色： 用 95% 的乙醇脱色 30s，水洗。 6. 复染： 用番红复染 30s，水洗，用吸水纸吸干。 7. 镜检： 干后用油镜观察子囊孢子呈绿色、菌体和子囊孢子 呈粉红色。 五、实验报告 1. 结果 （ 1） 绘图说明你所观察到的酵母菌的细胞结构及出芽生殖方式。 （ 2） 绘图说明酿酒酵母的营养细胞 、 子囊和子囊孢的形态特征 。 2. 思考题 （ 1） 吕氏碱性美蓝染液浓度和作用时间的不同 ， 对酵母菌死细胞数量 有何 影响试分析其原因 。 （ 2）在显微镜下，酵母菌有哪些突出的特征区别于一般细菌 （ 3）如何区别酵母菌的营养细胞和释放出子囊外的子囊孢子 （ 4）酵母菌在实际应用中有什么作用？ 酵母菌图片（ 1） 酵母菌图片（ 2） 酵母菌图片（ 3） 酵母菌子囊孢子的形成过程 1、 2、 3、 4：两个细胞结合； 5：接合子； 6、 7、 8、 9：核分裂； 10、 11：核形成孢子
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