动物染色体工程HXY

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1、第 10章 动物染色体工程 染色体工程 (chromosome engineering)是按 照人们的需要对生物的染色体进行操作， 添 加、削减或替换染色体 ，从而达到定向育种 或创造人工新物种的目的。 1 真核细胞染色体的组成 组蛋白： H1、 H2A、 H2B、 H3、 H4； 非组蛋白： HMG、 DNA结合 蛋白 DNA： 不重复序列；中度重复 序列；高度重复序列 少量的 RNA； 从 DNA到染色体的包装压缩 DNA链 核小体 螺线管 染色单体 超螺旋 压缩比例： 7 6 40 5 = 8400 （ 1： 7） （ 1： 6） （ 1： 40） （ 1： 5） Gene Expres

2、sion 染色体组 染色体组 染色体组型 染色体倍性 体细胞中的一组非同源染色体，它们在形态和功能上各不相同，但是，携带着控 制一种生物生长发育、遗传和变异的全部信息，这样的一组染色体，叫做一个 染色体组 。 染色体组型 是指一个体细胞中全部染色体的数目、大小和形态特征。 染色体倍性 是指细胞中包含的染色体组数或基数。 Human mitotic chromosomes and karyotype 染色体组用符号“ X”表示 生物体的体细胞染色体数用 2n表示，无论是二倍 体还是多倍体， 2n只表示体细胞的染色体数，并不 表示其倍性，如： 玉米体细胞染色体数 2n=20， 普通小麦体细胞染色体

3、数 2n=42， 要正确表示倍性应写成： 玉米 2n=2X=20， 普通小麦 2n=6X=42。 符号“ n”和“ X”的区别与联系 10 生殖细胞的减数分裂 骡 子 母马和公驴的后代 11 为什么骡子不能繁殖后代？ 马的染色体数是 64条，驴的染色体数是 62 条，马的卵子染色体数是 32条，驴的精子 染色体数是 31条，通过精卵结合发育成的 新个体 骡子的染色体数是 63条。 骡子的染色体联绘紊乱，因此骡子的生殖 细胞不能分化发育成完整的个体。 13 骡子生育的概率极低 骡子性成熟以后，再形成精子或卵子时，每条染 色体都没有相对应的同源染色体进行配对，这样 每一条染色体分到哪个配子里是随机

4、的，在这些 配子中，只有配子里的染色体完全来自于马的， 或来自于驴的，这样的配子才有生育能力。 14 狮虎兽（ liger） 雄狮和雌虎交配产生的后代。 狮虎兽的体型比狮或虎都要 大，又同时具备两者之间的 外貌特征；狮子与老虎相恋、 怀孕的概率极低，即使在人 工饲养的环境下，虎、狮受 孕的机会也仅为 1至 2。 幼兽由于先天不足等原因， 成活率仅为五十万分之一左 右。据资料显示，目前世界 上存活的狮虎兽只有 20只左 右。 15 狮虎兽 狮 虎 虎狮兽 17 动物染色体工程 染色体倍性改造 染色体结构改造 人工染色体的利用 18 10.1 动物染色体倍性改造 定义：指有目的、有计划地增加或减少

5、 一组或几组同源或异源染色体，以创造 动植物新品种的一项染色体工程技术。 主要包括： 多倍体育种 单倍体育种 19 10.1.1 动物的多倍体育种 多倍体（ polyploidy） :是指体细胞中含有三个 或三个以上染色体组的个体 多倍体产生机制： 通过卵细胞第二极体的保 留或受精卵早期有丝分裂的抑制而实现 20 10.1.1 动物的多倍体育种 1染色体加倍技术 (人工诱导 ) （ 1） 化学诱导法 秋水仙素 细胞松弛素 B （ 2） 物理学方法 1）温度休克法 2）水静压法 (3） 生物学方法 21 1.化学方法 A. 细胞松驰素 B(cytochalasin)： 能抑制肌动蛋白聚合成微丝，

6、从而 抑制细胞质分 裂 ，使用最早、最广泛，其诱导效果也最突出。 B. 秋水仙素 (colchicine)： 主要用于植物 阻止细胞分裂过程中的 纺缍体 的形成，可使染色 体正常复制而细胞不发生分裂，从而形成同源多 倍体细胞。 C. 其他： N2O 特点： 化学药物价格昂贵，有毒性 2.物理学方法 A、 温度休克法 原理： 引起细胞内酶构型的变化，不利于酶促反应的进行， 导致细胞分裂时形成纺缍丝所需的 ATP供应受阻。抑制 第二极体的释放，诱导三倍体或四倍体 方法： 冷休克法（ 0-5 ）和热休克法（ 30 左右） 特点： 操作简单，成本低廉，对胚胎发育影响小，有利于 养殖场大规模生产使用 适

7、用： 冷水鱼类应用热休克法，温水性鱼类用冷休克效果 较好 关键： 成功阻止第二次成熟分裂和第二极体的排出 2.物理学方法 B、水静压法 原理： 抑制第二极体的排出或第一次卵裂 方法： 65kg/cm2 特点： 诱导率高（ 90以上），处理时间短，对受 精卵损伤小，成活率高。 需要专门的设备 水压机，成本较高，不 适于大规模生产。 3. 生物学方法 动物通过杂交方法 尤其是种间杂交获 得异源多倍体。 种 间杂交导致第二极 体不排出。 草鱼 三角鲂 (2n=48) ( 2n =48) 草鲂杂种 (3n=72) 人工诱导三倍体的方法 直接途径， 即用物理或化学的方法对受精卵 进行处理，阻碍第二极体外

8、排。（即前述的 物理法、化学法） 间接途径， 即首先诱导获得四倍体，待四倍 体个体性成熟后再与二倍体个体交配，从而 获得三倍体子代。 26 三倍体 植物 27 28 三倍体 动物 2多倍体的倍性鉴定 （ 1）直接法 1）染色体计数： 是鉴定多倍体的一个准确的直接方法， 但比较费时。 2） DNA含量测定 ：细胞 DNA含量测定是倍性鉴定的另 一个有效的直接方法。 （ 2）间接法 1）核体积测量 2）蛋白质电泳 3）生化分析 30 31 3动物多倍体育种的意义 1）多数具有良好的生长率 2）低等动物的种间杂交优势非常明显 3）巨大性 4）育性低 (四倍体可育 ) 32 鱼类三倍体育种的意义 三倍

9、体是非偶数染色体组，阻碍了生殖细胞正 常的减数分裂，结果导致性腺不能发育。不育 的三倍体经济鱼类因为没有性成熟阶段性腺发 育的能量损耗，所以有以下优点： 避免了性腺发育阶段和产卵季节鱼肉质量下降 并延长了上市时间 避免了性腺发育阶段的生长停滞和死亡率增加 缩短了养殖周期，减少了养殖成本并可养成大 型个体 33 利用三倍体鱼类不育性的优点， 人们可以达到这样的目的： 获得生长速度较快的三倍体品种，提高鱼 类养殖的经济效益 控制养殖鱼类的过度繁殖和防止对天然资 源的干扰 34 湘云鲫 由湖南师 范大学生命科学学 院刘筠院士培育 35 36 Triploid Grass Carp三倍体草鱼 37 1

10、0.1.2 动物的单倍体育种 1人工单性生殖 （ 1）雌核发育 gynogenesis dindenisis （ 2）雄核发育 androgenesis ndrdenisis 38 10.1.2 动物的单倍体育种 1.雌核发育 ： 指精子虽然能正常地钻入卵子中并 激活卵子，但精子的细胞核并未参与卵球的发育， 胚胎的发育仅在 母体遗传物质 的控制下进行。 方法： 经遗传失活的动物精子刺激而使卵子发育 为正常的 二倍体 动物。 39 抑制第二极体外排 抑制第一次卵裂 精子遗传物质失活 40 Haploid embryos are generated by mock-fertilizing eggs

11、 with UV-irradiated sperm (which cannot contribute genetically), and can survive a few days. Haploids can be rescued by suppressing formation of the polar body with pressure treatment shortly after fertilization. 41 朱 洗 细胞学家。浙江临海人。 1931年获法国国家博士学 位。中国科学院实验生物研究所所长。长期从事两 栖类、鱼类、家蚕等动物卵子成熟、受精等研究 。 1961年使人

12、工雌核发育的雌蟾蜍与雄蟾蜍交配，繁 殖出 没有外祖父的蟾蜍 ，证明了单性生殖的高等动 物仍保有传代的能力。 42 雌核发育的意义 雌核发育具有产生单性种群的能力 迅速地产生同源型二倍体克隆 可通过克隆自交，即以激素致使性逆转 为雄性，再与同胞姐妹交配，获得强壮的纯 系同型配子二倍体，然后借助于雌核发育， 产生新的纯系来筛选除去有害的等位基因， 以改良近亲繁殖系 10.1.2 动物的单倍体育种 2.雄核发育： 用经过紫外线、 X线或线处理 的卵子与正常的精子受精，再在适当时间施以 冷、热或高压等物理处理，使进入卵子内的精 子染色体加倍，而发育成完全为父本性状的二 倍体。 定义： 遗传失活的卵子与

13、精子结合，发育成只 有 父本 染色体个体的一种特殊生殖方式。 44 人工诱导雌核发育的方法 （ 1）精子遗传物质的失活 辐射处理（紫外线）、 化学物质、 直接去除受精卵中的雄性原核 （ 2）细胞分裂的阻止（雌核染色体二倍 化） 温度休克、静水压力、化学抑制剂处理 45 Heat-shock treatment to activated/fertilized eggs of Indian major carps to induce diploid gynogenesis/polyploidy respectively 热休克 46 人工诱导雌核发育的方法 （ 3）雌核发育的鉴别 鉴别雌核发育的个

14、体，通常以颜色、形状 和生化等方面的指标为根据。 目前，还采用细胞学和遗传标记的方法 47 10.2 动物染色体结构的改造 染色体片段的删除和重排 染色体的易位工程 48 染色体结构变异 易位： 一个染色体上某一 区段跟另一非同源染色 体上的区段发生互换 缺失： 染色体的某一区段 及带有的基因一起丢失 倒位： 染色体上某一区段 连同它带有的基因顺序 发生 180度倒转 重复： 一个染色体上增加 了相同的某个区段。 10.3 人工染色体 人工染色体 酵母人工染色体 细菌人工染色体 哺乳类人工染色体 人工染色体的应用 50 人工染色体 染色体要确保在细胞分裂中保持稳定性，必须要能够自 我复制和向子

15、细胞中平均分配，需要 3个关键序列： 1.自主复制 DNA序列（ ARS） 是 DNA复制的起点，确保染色体能够开始自我复制。 2.着丝粒 DNA序列（ CEN） 确保染色体在细胞分裂时能平均分配到子细胞中。 3.端粒 DNA序列（ TEL） 使 DNA能结束复制，确保染色体的独立性和稳定性。 51 人工染色体 定义： 人工构建的含有 复制起始点、着丝粒 和端粒 三个关键序列的 载体 系统。 52 现正在研究的人工染色体有三种： 酵母人工染色体（克隆容量 105-1010bp） （ yeast artificial chromosome, YAC） 细菌人工染色体（常用于克隆约 300bp片段

16、） （ bacterial artificial chromosome, BAC） 哺乳类人工染色体 （ mammalian artificial chromosome, MAC） 53 YAC 载体基本序列元件 ： 酵母染色体 DNA自主复制顺序（ ARS） ： 负责 DNA复制 酵母染色体的着丝粒顺序（ CEN）： 保证酵母细胞分裂时染色体的分配 酵母染色体的端粒顺序（ TEL）： 维持染色体结构的稳定性（两端各 一个） 选择标记：用于重组克隆的筛选 pYAC4是一个大肠杆菌穿梭质粒， 含有 Amp大肠杆菌筛选标记 YAC重组载 体构建示 意图 完整的染色体 DNA的提取 基因组 DNA酶

17、切大片段的获取 YAC载体臂的制备 YAC臂与目的 DNA大片段的连接 YAC重组体对酵母的转化 YAC基因库的鉴定 目的基因 YAC克隆的筛选 目的基因 YAC克隆的鉴定 YAC克隆技术流程 YAC的主要用途是： (1)YAC可容纳大片段的外源 DNA ，而且在 构建基因组文 库 时需要较少的克隆。 (2)用 YAC克隆构建的物理图谱在复杂的生物 基因组分析 和 DNA测序 中发挥着重要作用。目前，用 YAC提供大片段 DNA构建染色体图谱的技术已在人类、植物、昆虫、鸟 类、两栖类等动物中得到广泛应用，相比于早期的 DNA 片段载体， YAC是容纳大片段外源 DNA的首选载体。 (3)在 基

18、因功能研究 中，基因嵌入及转基因技术都采用 了 YAC克隆系统。通过 YAC嵌入的基因不仅片段长，而且 嵌入的基因更适于体内表达，并有利于基因保持其固有 的空间构象和功能的发挥。 YAC的缺点： 1、插入片段大，稳定性较差，不易操作 2、插入的大片段常发生缺失，使文库不完整 3、 YAC与酵母天然染色体分子结构相似分离 时难与天然染色体分开 4、文库中的嵌合现象严重 5、因插入片段大，往往发生序列重排，造成 序列错乱。 细菌人工染色体（ BAC） 新一代 BAC载体为 7.4kb的 环状质粒 ，主要结 构有： F因子的 parA， parB， parC基因 保证低拷贝的 BAC质粒在大肠杆菌分

19、裂时均匀分配到 子代细胞。 起始 oriS基因 严密控制，决定低拷贝数和复制起始 解旋酶基因 repC 易于 DNA复制和决定复制方向 选择标志基因 Cmr 氯霉素抗性基因 lacZ基因 颜色鉴别重组子，外源基因插入其中 loxP和 cosN位点 易于克隆 DNA回收和操作 BAC的特点： 宿主中只有 1-2个拷贝 插入片段不易变化，稳定遗传 避免嵌合现象 转化效率高 主要用于 300bp一下 DNA克隆 60 哺乳类人工染色体（ MAC） 以哺乳动物细胞为宿主的人工染色体。 61 YAC和 MAC应用于基因治疗领域是一种理想的基因 转移新载体，有以下优点 ： 1）可携带的外源基因容量大，包装

20、容量可达 500 600kb，可以满足几乎所有的单个基因的基因组 DNA的需 要。 2）可以携带较长片段的基因表达调控顺序，能够较 好地调节基因表达水平以及基因的靶向表达。 3）外源基因存在于人工染色体中，可以不整合到细 胞基因组中，因而不会激活原癌基因或使其它有功能基 因失活，而且理论上能够在细胞中较稳定地存在。 人工染色体的应用 物理图谱和定位克隆 基因功能鉴定和转基因的研究 染色体结构和功能关系研究 基因治疗 63 第三篇 植物细胞工程 64 植物组织培养 根、芽 完整植株 脱分化 细胞分裂素 生长素 再分化 离体的植物器官、组织或细胞 愈伤组织 65 植物细胞工程的主要技术： 植物组织培养 植物的快速繁殖 体外单倍体诱导与单倍体育种 植物胚胎培养 体细胞胚胎发生与人工种子 植物原生质体融合技术 植物染色体工程 植物转基因技术 66 思考题 简介动物染色体倍性改造的主要方法。 何谓雌核发育？如何人工诱导雌核发育？ 何谓人工染色体？有何应用价值？ 请 简介鱼类三倍体育种的方法和意义 。 67