单克隆抗体的制备方法

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1、单克隆抗体的制备措施动物的选择与免疫 1动物的选择 纯种BAL/小鼠，较温顺，离窝的活动范畴小，体弱，食量及排污较小，一般环境干净的实验室均能饲养成活。目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALAC小鼠。 2免疫方案 选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的MA至关重要。一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。(1)可溶性抗原免疫原性较弱,一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐剂。常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。 初次免疫抗原150加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.1ml,0.2m点)3周后第二次免疫 剂量同上

2、，加福氏不完全佐剂皮下或ip（腹腔内注射）(i剂量不适宜超过0.5l) 3周后第三次免疫 剂量同一，不加佐剂，p（57天后采血测其效价) 3周 加强免疫，剂量550g为宜，ip或v(静脉内注射)3天后取脾融合 目前，用于可溶性抗原(特别是某些弱抗原)的免疫方案也不断有所更新，如：将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可减少抗原的使用量。变化抗原注入的途径,基本免疫可直接采用脾内注射。使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，增强免疫细胞对抗原的反映性。 (2)颗粒抗原免疫性强，不加佐剂就可获得较好的免疫效果。以细胞性抗原为例，免疫时规定抗原量为11个细胞。 初次免

3、疫 110/0.5m p 23周后 第二次免疫 17.5m i3周后 加强免疫(融合前三天)117/0.5m p或iv 取脾融合细胞融合 .细胞融合前准备 (）骨髓瘤细胞系的选择:骨髓瘤细胞应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高,也便于接种杂交瘤在同一品系小鼠腹腔内产生大量Mcb。常用的骨髓瘤细胞系见表2-4。表2-4用于融合实验的重要骨髓瘤细胞系名 称来 源耐受药 物Ig链H LP3/X3-(3)BALB/C骨髓瘤MP-218-氮鸟嘌呤r1 KP3/X3-8.63(X63-Ag.6)P/X3-A氮鸟嘌呤 -P3/NSI-1Ag-(NS-1)3/X63-Ag88氮鸟嘌呤K(不分泌型）P3/

4、X6-Ag.l(l)(3BAB/C脾细胞)杂交瘤-氮鸟嘌呤 SP2A14(S2/0)（X63BLB/C脾细胞)杂交瘤8-氮鸟嘌呤-FBALB/骨髓瘤氮鸟嘌呤- -194/5.XXO.B.1P3/63Ag85-溴脱氧尿嘧啶核苷- MPC1145.6TG1.LB/C骨髓瘤P-1-巯鸟嘌呤r2b K210.CY3.Ag1.23LOU大鼠骨髓瘤R2108-氮鸟嘌呤 KG5006TG-1人骨髓瘤G506-巯鸟嘌呤r1 K-266R人骨髓瘤U-268氮鸟嘌呤 骨髓瘤细胞的培养可用一般的培养液,如RP640,DMEM培养基。小牛血清的浓度一般在102%,细胞浓度以04505/ml为宜，最大浓度不得超过06/

5、ml。当细胞处在对数生长的中期时，可按：1：1的比例传代。每3天传代一次。细胞在传代过程中,部分细胞也许有返祖现象，应定期用8氮鸟嘌呤进行解决,使生存的细胞对HT呈均一的敏感性。 (2）饲养细胞：在组织培养中,单个或少数分散的细胞不易生长繁殖，若加入其他活细胞，则可增进这些细胞生长繁殖,所加入的这种细胞数被称为饲养细胞。在制备Mcb的过程中，许多环节需要加饲养细胞,如在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中，加入饲养细胞是十分必要的。常用的饲养细胞有：小鼠腹腔巨噬细胞（较为常用）、小鼠脾脏细胞或胸腺细胞。也有人用小鼠成纤维细胞系3T3经放射线照射后作为饲养细胞。饲养细胞的量为一般为214或10

6、5细胞/孔。 2.细胞融合的环节（)制备饲养细胞层:一般选用小鼠腹腔巨噬细胞。 与免疫小鼠相似品系的小鼠,常用BABC小鼠,61周 拉颈 处死，浸泡在75%酒精内，35in 用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜 用无菌注射器注入5ml预冷的培养液（严禁刺破肠管) 反复冲洗，吸出冲洗液 冲洗液放入0ml离心管，10rpm分离6min用0%小牛血清(NCS）或胎牛血清(FS)的培养液混悬,调节细胞数至10/ml 加入9孔板，10l/孔 放入37。c O孵箱培养 （2)制备免疫脾细胞 最后一次加强免疫3天后小鼠拉颈处死 无菌取脾脏,培养液洗一次 脾脏研碎，过不锈钢筛网 离心,细胞用培养液洗次 计数 取108

7、脾淋巴细胞悬液备用 （)制备骨髓瘤细胞 取对数生长骨髓瘤细胞离心 用无血清培养液洗次 计数，获得07细胞备用 (）融合 将骨髓瘤细胞与脾细胞按1:10或1：5的比例混合在一起,在50ml离心管中用无血清不完全培养液洗1次，离心,120rm，mi；弃上清，用吸管吸净残留液体，以免影响聚乙二醇（EG)浓度。轻轻弹击离心管底,使细胞沉淀略松动。 0s内加入37预温的1ml 45%PEG（分子量000)溶液,边加边轻微摇动。37水浴作用0s。 加37。C预温的不完全培养液以终结PE作用,每隔2mn分别加入1ml、2ml、m、ml、5ml和6。 离心,00rpm, mi。 充上清,用含20%小牛血清HA

8、T选择培养液重悬。 将上述细胞，加到已有饲养细胞层的96孔板内，每孔加1l。一般一种免疫脾脏可接种4块6孔板。 将培养板置37、5CO2培养箱中培养。选择杂交瘤细胞及抗体检测 1HAT选择杂交瘤细胞 脾细胞和骨髓瘤细胞经PEG解决后，形成多种细胞的混合体,只有脾细胞与骨髓细胞形成的杂交瘤细胞才故意义。在HAT选择培养液中培养时,由于骨髓瘤细胞缺少胸苷激酶或次黄嘌呤鸟嘌呤核糖转移酶,故不能生长繁殖,而杂交瘤细胞具有上述两种酶,在HA选择培养液可以生长繁殖。 在用T选择培养12天内,将有大量瘤细胞死亡,34天后瘤细胞消失，杂交细胞形成小集落,HAT选择培养液维持10天后应换用H培养液,再维持周，改

9、用一般培养液。在上述选择培养期间,杂交瘤细胞布满孔底1/10面积时,即可开始检测特异性抗体,筛选出所需要的杂交瘤细胞系。在选择培养期间，一般每23天换一半培养液。 2.抗体的检测 检测抗体的措施应根据抗原的性质、抗体的类型不同,选择不同的筛选措施,一般以迅速、简便、特异、敏感的措施为原则。 常用的措施有：(1）放射免疫测定(RA)可用于可溶性抗原、细胞Mcb的检测。(2）酶联免疫吸附实验（ISA)可用于可溶性抗原、细胞和病毒等McA的检测。(）免疫荧光实验适合于细胞表面抗原的Mb的检测。(4）其他如间接血凝实验、细胞毒性实验、旋转粘附双层吸附实验等。杂交瘤的克隆化 杂交瘤克隆化一般是指将抗体阳

10、性孔进行克隆化。由于通过HAT筛选后的杂交瘤克隆不能保证一种孔内只有一种克隆。在实际工作中,也许会有数个甚至更多的克隆，也许涉及抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞、所需要的抗体（特异性抗体)分泌细胞和其他无关抗体的分泌细胞。要想将这些细胞彼此分开就需要克隆化。克隆化的原则是，对于检测抗体阳性的杂交克隆尽早进行克隆化,否则抗体分泌的细胞会被抗体非分泌的细胞所克制，由于抗体非分泌细胞的生长速度比抗体分泌的细胞生长速度快,两者竞争的成果会使抗体分泌的细胞丢失。虽然克隆化过的杂交瘤细胞也需要定期的再克隆,以避免杂交瘤细胞的突变或染色体丢失,从而丧失产生抗体的能力。 克隆化的措施诸多,最常用的是有限稀释法和软

11、琼脂平板法。 1.有限稀释法克隆 (1）克隆前1天制备饲养细胞层（同细胞融合）。 2)将要克隆的杂交瘤细胞从培养孔内轻轻吹干，计数。 ()调节细胞为10个细胞/ml。 (4）取头天准备的饲养细胞层的细胞培养板，每孔加入稀释细胞100。孵育于37、5C2孵箱中 。 （5)在第天换液，后来每天换液1次。 ()8天可见 细胞克隆形成,及时检测抗体活性。 （7）将阳性孔的细胞移至4孔板中扩大培养。 (8)每个克隆应尽快冻存。 2软琼脂培养法克隆 （)软琼脂的配制:具有20%NCS(小牛血清)的2倍浓缩的PMI14。 1%琼脂水溶液：高压灭菌,4预热。 0.5%琼脂:由1份琼脂加1份含20小牛血清的2倍

12、浓缩的RPI4配制而成。置42保温。 (）用上述.5%琼脂液(具有饲养细胞)1m倾注于直径为cm的平皿中,在室温中待凝固后作为基底层备用。 （3）按00/ml，/或5000ml等浓度配制需克隆的细胞悬液。 （）ml05琼脂液(4预热)在室温中分别与ml不同浓度的细胞悬液相混合。 (5）混匀后立倾注于琼脂基底层上,在室温中10min,使其凝固，孵育于7、5%O2孵箱中。 （6）45天 后即可见针尖大小白色克隆,1天后,直接移种至含饲养细胞的24孔中进行培养。 (7)检测抗体，扩大培养,必要是地再克隆化。杂交瘤细胞的冻存与复苏 1杂交瘤细胞的冻存 及时冻存原始孔的杂交瘤细胞每次克隆化得到的亚克隆细

13、胞是十分重要的。由于在没有建立一种稳定分泌抗体的细胞系的时候，细胞的培养过程中随时也许发生细胞的污染、分泌抗体能力的丧失等等。如果没有原始细胞的冻存,则可因上述意外而前功尽弃。 杂交瘤细胞的冻存措施同其她细胞系的冻存措施同样，原则上细胞应在每支安瓿含1106以上，但对原始孔的杂交瘤细胞可以因培养环境不同而变化,在24孔培养板中培养,当长满孔底时,一孔就可以装一支安瓿冻存。细胞冻存液:0%小牛血清；40%不完全培养液；0%MSO(二甲基亚砜)。 冻存液最佳预冷,操作动作轻柔、迅速。冻存时从室温可立即降至0后放入-7超低温冰箱，次日转入液氮中。也可用细胞冻存装置进行冻存。冻存细胞要定期复苏，检查细

14、胞的活性和分泌抗体的稳定性，在液氮中细胞可保存数年或更长时间。2细胞复苏措施 将玻璃安瓿自液氮中小心取出,放37水浴中,在1min内使冻存的细胞解冻，将细胞用完全培养液洗涤两次,然后移入头天已制备好的饲养层细胞的培养瓶内,置37、5CO2孵箱中培养，当细胞形成集落时，检测抗体活性。单克隆抗体的大量生产 大量生产单克隆抗体的措施重要有两种: （1)体外使用旋转培养管大量培养杂交瘤细胞，从一清液中获取单克隆抗体。但此措施产量低,一般培养液内抗体含量为60g/ml,如果大量生产,费用较高。 (2)体内接种杂交瘤细胞，制备腹水或血清。 实体瘤法:对数生长期的杂交瘤细胞按13107/l接种于小鼠背部皮下

15、，每处注射2,共24点。待肿瘤达到一定大小后(一般10天)则可采血，从血清中获得单克隆抗体的含量可达到10mg/m。但采血量有限。 腹水的制备:常规是先腹腔注射05m Pritae (降植烷)或液体石蜡于AB/C鼠,2周后腹腔注射1106个杂交瘤细胞,接种细胞0天后可产生腹水，密切观测动物的健康状况与腹水征象,待腹水尽量多，而小鼠频于死亡之前，处死小鼠,用滴管将腹水吸入试管中，一般一只小鼠可获51m腹水。也可用注射器抽提腹水,可反复收集多次。腹水中单克隆抗体含量可达到510ml，这是目前最常用的措施，还可将腹水中细胞冻存起来,复苏后转种小鼠腹腔则产生腹水块、量多。单克隆抗体的鉴定 对制备的Mc

16、b进行系统的鉴定是十分必要的，应做下述几种方面的鉴定： 1抗体特异性的鉴定 除用免疫原(抗原）进行抗体的检测外，还应当用与其抗原成分有关的其他抗原进行交叉实验，措施可用ELISA、IFA法。例如：制备抗黑色素瘤细胞的Mcb，除用黑色素瘤细胞反映外，还应当用其他脏器的肿瘤细胞和正常细胞进行交叉反映，以便挑选肿瘤特异性或肿瘤有关抗原的单克隆抗体。制备抗重组的细胞因子的单克隆抗体,应一方面考虑与否与体现菌株的蛋白有交叉反映，另一方面是与其他细胞因子间有无交叉。 2Mcb的类与亚类的鉴定 一般在用酶标或荧光素标记的第二抗体进行筛选时已经基本上拟定了抗体的Ig类型。如果用的是酶标或荧光素标记的兔抗鼠IgG或IgM,则检测出来的抗体一般是gG类或M类。至于亚类则需要用原则抗亚类血清系统作双扩或夹心ELIA来拟定。在作双扩实验时,如加入适量的PG(3%)，更有助于沉淀线的形成。 3Mcb中和活性的鉴定 用动物或细胞的保护实验来拟定Mcb的生物学活性。例如，如果拟定抗病毒McAb的中和活性，则可用抗体和病毒同步接种于易感的动物或敏感的细胞，来观测动物或细胞与否得到抗体的保护。 4.cA辨认抗原表位的鉴定 用竞争结合实验，测相加指数的措施,测定McAb所辨认抗原位点,来拟定MAb的辨认的表位与否相似。 5MAb亲合力的鉴定 用ELISA或RIA竞争结合实验来拟定MA与相应抗原结合的亲合力。