碱性磷酸酶的分离纯化及比活性与米氏常数测定

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1、碱性磷酸酶的分离纯化及比活性与米氏常数测定一、实验原理(1).碱性磷酸酶的分离纯化1. 机械破碎法制备肝匀浆低浓度乙酸钠：低渗破膜低浓度乙酸镁：保护和稳定AKP2有机溶剂沉淀法分离纯化AKP加入不同有机溶剂重复离心正丁醇：沉淀部分除AKP的蛋白质33%丙酮、30%乙醇：溶解AKP50%丙酮、60%乙醇：沉淀AKP(2).比活性测定1. 比活性的定义*单位重量的蛋白质样品中所含的酶活性单位。*通常用每毫克蛋白质具有的酶活性单位来表示。*用以鉴定酶的纯化程度，是酶分离提纯完成的评价指标之一2. 测定样品的比活性必须测定：*每毫升样品中的酶活性单位数。*每毫升样品中的蛋白质毫克数。3. 磷酸苯二钠法

2、测定碱性磷酸酶活性反应原理+ h3c-n(yof - ow 十閘X/ ONa0II+ HOPONaIONaN/ C =0 I磴性KiFe(CN)sH$C-N一 C-NHz4一氨基安替比林严%HSCNC =0甩 CYC-NH?O醞術生物(3).米氏常数测定Km即为米氏常数，Vmax为最大反应速度如上式表示,米氏常数是反应速度为最大值的一半时的底物浓度,因此, 米氏常数的单位为 mol/L。当反应速度等于最大速度一半时;即V = 1/2 Vmax, Km =*吸光度表示不同底 物浓度时的酶反应速度。以吸光度的倒数作纵坐标，以底物浓度的倒数作横坐标，按Lineweaver-Burk作图法可求出Km值

3、。SJ图 恋倒数作图法斜率耘二. 器材721 分光光度计台式离心机恒温水浴锅微量移液器 托盘天平匀浆器试管三.试剂1. 0.5mol/L醋酸镁溶液称取醋酸镁5.3625g溶于蒸馏水中，稀释至50ml.2. 0.1mol/L醋酸钠溶液称取醋酸钠0.0820g溶于蒸馏水中，稀释至 10ml.3. 0.01mol/L醋酸镁-醋酸钠溶液取0.5mol/L醋酸镁溶液2ml及O.1mol/L醋酸钠溶溶液10ml,混合均匀后加蒸馏水稀释至100ml.4. 丙酮(分析纯).5.95%乙醇(分析纯).6.Tris 缓冲液(Ph8.8)称取 Tris 6.05g,用蒸馏水溶解成50ml,为 0.1mol/L Tr

4、is液，取0.1mol/L Tris液10ml,加0.5mol/L醋酸镁2ml,加蒸馏水80ml,再用1%醋酸 调pH至8.8,然后用蒸馏水稀释至100ml.7. 0.01mol/L基质液称取磷酸苯二钠6百卩04四2.2H2O)03g,4-氨基安替比林0.15g,分别溶于煮沸冷却后的蒸馏水中;两液混合并蒸馏水稀 释至50ml,加 0.2ml氯仿防腐,盛于棕色瓶中，冰箱内保存，可用一星期;临用时与等量0.1mol/L pH10的碳酸盐缓冲液混合即可8. 0.1mol/L pH10的碳酸盐缓冲液称取无水碳酸钠0.318g及碳酸氢钠0.168g溶 于蒸馏水,稀释至 50ml.9. 碱性溶液量取05m

5、ol/L氢氧化钠溶液与0.5mol/L碳酸氢钠溶液各20ml,混合后加蒸馏水至100ml.10.0.5%铁氰化钾溶液称取铁氰化钾0.25g和硼酸0.75g,各溶于20ml蒸馏水中,溶解后两液混合均匀，再加蒸馏水至50ml,置棕色瓶中暗处保存.11. 0.1mol/L醋酸镁溶液称取醋酸镁0.2145g溶于蒸馏水中，稀释至10ml.12. 酚标准液(01mg/ml).四.实验步骤(1) “碱性磷酸酶分离纯化”实验操作2g兔肝剪碎置于玻璃匀浆管中，加0.01 mol/L醋酸镁弋01 mol/L fin|酸纳溶液6 ml,在匀浆器上匀浆,10 000 rpm, 1分钟。 肝匀浆上清液（弃去）沉淀倒人刻

6、度离心管，记录体积（A液）（约8 nil）。吸出A液0.1 ml置于另一试 管中,在此试管巾加4.9 ml pH 88Tris缓冲液（A管）,待测比活性用。然后 在A液中加2 ml正丁惇，用玻棒充分搅拌35分钟。随后室温放置30分 钟。单层滤纸过滤，取滤液,加等体积冷丙嗣,混匀,2 000 rpm离心5分钟。加0.5 mol/L醋酸镁4 mI（B液），记录体积。取B液01 ml置于另一试借中，加4.9 ml pH 8.8 T吊缓冲液（B管），待测比活性川。沉淀（弃去）上清液+ 95%冷乙璋至60%（约4.3 ml）,混匀,2 500 rpm离心5分钟。上消液（弃去）沉淀加0.5 mol/L 酸

7、钱3ml溶解，记录体积（C液）。取C液01 ml 置于另一试管中，加2.0 ml pH 88Tris缓冲液（C噌）,待测比活 性用。加冷丙銅至33%（约1.5 ml）,2 000 rpm离心5分钟。上清液（弃去）沉淀加5 ml pH 8.8 Tris缓冲液,2 000 rpm离心5分钟。加冷丙圉至50%（约1.5 ml）,3 500 rpm离心10分钟 I I沉淀（弃去）上淸液（D液，含部分纯化酶），取D液0.5血置于 另一试管中，加2 ml pH 8.8 Tris缓冲液（D管）, 待测比活性用。(2).“碱性磷酸酶比活性测定”实验操作1.样品中碱性磷酸酶活性测定:(1).取5 支试管,编号,

8、按表1 操作:表1ABCD标准空白各阶段稀释液(ml)0.10.10.1 0.1 -0.1mg/ml 酚标准液(ml)-0.1 -pH8.8Tris 缓冲液(ml)-0 1置37C水浴中保温5分钟复合基质液(ml) 3.0 3.03.03.03.03.0混匀,37C水浴中准确保温15分钟.保温结束后,各管立即加入1.0ml碱性溶液终止反应再加入0.5%铁氰化物钾2.0ml,立即混匀静置10min,在510nm波长下比色测定.2. 酶活性单位计算每毫升酶液中酶活性单位=测定OD/标准ODX标准管中酚含量X1/0.1X 稀释倍数3. 样品中蛋白质含量的测定测定蛋白质时,保留的A管还需稀释5倍为A管

9、，否则蛋白质浓度太高其余各管 不需再稀释，各用1.0ml进行测定.表2ABCD空白各阶段稀释液(ml) 1.01.01.01.0-0.1mg/ml 酚标准液(ml)1.0pH8.8Tris 缓冲液(ml) 5.05.05.05.05.0混匀，置2025C水浴中保温10分钟复合基质液(ml) 0.50.50.50.50.5立即振摇均匀在2025C保温30min后，于650nm波长处比色.蛋白质浓度计算:从Lowry法标准曲线查得的蛋白质毫克数乘以稀释倍数即为 每毫升样品中蛋白质毫克数.4. 比活性及得率计算碱性磷酸酶比活性=每毫升样品中碱性磷酸酶活性单位数/每毫升样品中蛋白质 毫克数纯化倍数二各

10、阶段比活性数/匀浆(A液)比活性数得率二各阶段酶的总活性单位/匀浆(A 液)中的酶的总活性单位x 100%5. 实验结果将上述各实验计算结果填入表3 内.表3分离总体积蛋白质总蛋白每毫升酶总活性比活性纯化得率阶段 (ml) 浓度 (mg) 活性单位单位 (U/mg ) 倍数(%)(mg/ml)(U/ml) (U)匀浆(A液)第一次丙酮沉淀(B液)第二次丙酮沉淀(C液)第三次丙酮沉淀(D液)3. 米氏常数测定1.取15只试管，按照下表操作，17号重复两组，0号为空白对照。管号012345670.01mol/l 底物 液ml00.10.20.30.40.60.810PH10/0.1mol /L碳酸

11、缓冲 液ml0.70.70.70.70.70.70.70.7蒸馏水ml1.21.11.00.90.80.60.40.237 C水浴保温5min最后一次上 清液ml0.10.10.10.10.10.10.10.1混匀，立即记录时间，将各管37C准确保温15分钟碱性溶液ml1.01.01.01.01.01.01.010复合基质液(ml)3.03.03.03.03.03.03.030充分混匀，放置15分钟;以6号空白管作对照，与510nm波长处比色测定2. Km 值的计算： 根据酚标准曲线计算出每管样品酚的含量，算出反应速度;以各管底物浓度的倒数为横坐标，各管反应速度的倒数为纵坐标，作图求tKm 值4. 酚标准曲线的绘制1.取14只试管，按照下表操作，06号重复两组，0号为空白对照。管号01234560.1mg/ml 酚标准液ml00.050.10.20.30.40.5蒸馏水ml2.01.951.901.801.701.601.5037C水浴保温5min碱性溶液ml1.01.01.01.01.01.010复合基质液(ml)3.03.03.03.03.03.030充分混匀，放置15分钟;以0号空白管作对照，于510nm波长处比色测定生命科学学院生物学类 3 班10111900112 贺小清10111900204 崔梦娇10111900111 孙仁强4 班 10111900205 赵怡珊