肝糖原的提取鉴定与定量

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1、生物化学实验报告姓 名： X 学 号： 专业年级: 级临床医学 组 别: 第3实验室 生物化学实验教学中心实验名称肝糖原的提取、鉴定、分离实验日期-12-0实验地点第9实验室合伙者 XX 指引教师张XX评分教师签名批改日期一、 实验目的1、 掌握组织样品的制备措施,理解其注意事项。2、 理解肝糖原提取、糖原和葡萄糖鉴定与蒽酮比色测定糖原含量的原理和注意事项,掌握其操作措施。3、 对的操作使用刻度吸管和可调微量取液器。4、 纯熟运用溶液混匀的多种措施。5、 对的掌握溶液转移的操作。6、 对的操作使用分光光度计。二、 实验原理 肝糖原的提取糖原储存于细胞内,采用沉没匀浆等措施可使细胞破碎,低浓度的

2、三氯醋酸能使蛋白质变性，破坏肝组织中的酶且沉淀蛋白质，而糖原仍稳定地保存于上清液中,从而使糖原与蛋白质等其她成分分离开来。糖原不溶于乙醇而溶于热水，故先用95%乙醇将绿叶中糖原沉淀,再溶于热水中。 糖原的鉴定糖原水溶液呈乳样光泽,遇碘呈红棕色。这是糖原中葡萄糖长链形成的螺旋中,依托分子间引力吸附碘分子后呈现的颜色。糖原还可被酸水解为葡萄糖，运用呈色反映和葡萄糖的还原性，可鉴定肝组织中糖原的的存在。CuO + 2NaOH = Na2SO4 + u(H）2Cu（OH)2 + 612O6= uH +氧化型葡萄糖 + H2OCuO H + Cu2O(红色）C（OH)2= H2O +uO （黑色） 肝糖

3、原的定量糖原在浓酸中可水解为葡萄糖，浓硫酸能使葡萄糖进一步脱水生成糠醛衍生物-羟甲基呋喃甲醛,此化合物再与蒽酮脱水缩合生成蓝色的化合物。该物质在62m处有最大吸取。糖含量在10100g范畴内，溶液颜色的深浅与可溶性糖含量成正比。运用此反映与同样解决的已知葡萄糖含量的原则溶液比色，通过原则对照法即可计算出样品中糖原的含量。糖原在浓碱溶液中非常稳定，故在显色之前，肝组织先置于浓碱中加热,以破坏其她成分,而保存肝糖原。三、 实验材料 仪器:1、 一般离心机,室温-0恒温水浴箱(x2），7型分光光度计，精度为 10mg级电子天平2、 剪刀、镊子、研钵3、 试管架，离心管,试管4、 刻度吸量管（2ml

4、,5ml),100l微量可调取液器5、 00ml容量瓶6、 白瓷反映板 试剂:鸡肝、9乙醇、0.31/(5%)三氯醋酸溶液、15molL Na溶液、浓HCl、125mol/L(50)a、碘试剂、班氏试剂、KOH溶液、原则葡萄糖液（50gL)蒽酮显色剂四、 实验环节 肝糖原的提取+5%CCl3COOH 1ml+5%CCl3COOH 3ml+蒸馏水2ml鸡肝约1.5g,剪碎研磨至乳状研磨成肝匀浆所有转入离心管中,离心3in(00r/in）取上清液+5ml 95%乙醇，混匀，静置10min离心5in(4000r/min)取沉淀沸水浴2min，溶解沉淀+50% NaOH 0.2ml+班氏试剂0.2ml

5、(4d)+浓HCl 0.2ml 糖原溶液ml白瓷板中 沸水浴加热15in,冷却 加碘试剂0.1l 加碘试剂0ml 糖原溶液0.1ml糖原水解液0.1ml(2d） 糖原水解液呈色对比 混匀沸水浴2mn，观测变化 注意事项：1、 提取肝糖原时,向上清液中加入等量的9%乙醇后，必须混匀。由于上清液为水溶液，比重不小于95乙醇，溶液提成两层。加之上清液已4ml多，加上等量乙醇,总量接近9ml,混匀操作比较困难,最佳用倾倒混匀,或用玻璃棒搅拌混匀。2、 糖原中葡萄糖螺旋链吸附碘产生的颜色与葡萄糖残基数的多少有关。葡萄糖残基在2个如下的会使碘呈现红色,20-30个之间使碘呈现紫色，60个以上的会使碘呈现蓝

6、色。淀粉中分支链较长,故呈蓝色，而肝糖原分枝中的葡萄糖残基在20个如下(一般-12个葡萄糖残基），吸附碘后呈现红棕色。3、 糖原水解液中鉴定葡萄糖时，加班氏试剂不能过量，否则反映液呈黑色浑浊,观测不到应有的成果。 肝糖原定量测定鸡肝 . +30% KOH 1.5ml沸水浴15min冷却，所有转入100m容量瓶中加水至标线,仔细混匀,获得糖原提取液取3支干净的试管,按下表操作:试剂（ml）空白管原则管样品管蒸馏水10原则葡萄糖溶液.0糖原提取液1.0.%蒽酮溶液2.52.52.5混匀，沸水浴10in，冷却。在72型或21型分光光度计620nm波长处，用空白管溶液调零，测定各管溶液的吸光度（).计

7、算:肝糖原（g100g肝组织）= X 0.5 X X X 1.1五、 实验现象与成果讨论 糖原水解液加班氏试剂沸水浴后无明显变化。 糖原溶液加碘试剂后呈红棕色,但与碘试剂本来颜色区别不大。 鸡肝加碱沸水浴后分层，上层为红棕色，下层无色。 加入蒽酮溶液并且水浴过后的空白管、原则管、样品管（由左至右）对比 将空白管在60nm处的A值设定为0,测得原则管、样品管的A值如下:空白管原则管样品管1060.20.6120.8530.610.1平均值00130.087肝糖原(g/100g肝组织)= X 005 X X1.1 0.525从肝糖原的定量实验中可知鸡肝样品中具有糖原,但在定性实验中成果不明显，可判断实验所采用的鸡肝样品含糖原量比较少,导致鸡肝糖原量少的因素也许是用于实验的鸡处在饥饿状态,糖原分解以维持血糖稳定，因此使肝中剩余的糖原量少于非饥饿状态下的鸡的肝糖原含量。