循环内皮细胞微粒

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1、循环内皮细胞微粒-动脉粥样硬化进展的标志各种心血管疾病都会引起循环微粒（MPS）水平升高，血浆中循环微粒（MPS）水 平升高可以将其视为血管功能改变的生物标记。内皮细胞激活或凋亡时，可以释放一种 复杂的亚微米（0. 11mm）小囊泡于血液中，临床上称之为循环微粒（MPS）。内皮 细胞微粒（EMPs）能引起生理和病理等变化，并且可以促进氧化应激和血管炎症等。血管 紧张素II,脂多糖，和过氧化氢引起的动脉粥样硬化可以诱发内皮细胞微粒（EMPs）释放。 然而，内皮细胞微粒（EMPs）也可以通过多种生理学途径产生，例如NADPH氧化酶促进 内皮形成ROS以及Rho激酶途径和丝裂原活化蛋白激酶等等。内皮

2、功能障碍是引起动 脉粥样硬化斑块形成的关键因素，而从破裂颈动脉斑块中释放的粥样硬化栓子，是中风 的主要致病因子。越来越多的证据表明，无论是在病情恶化或触发修复反应过程中，内 皮细胞微粒（EMPs）作为损伤标记物，在心血管疾病的发病机制中发挥着重要的作用。就 这个方面来说，我们已经证实内皮细胞微粒（EMPs）具有潜在的充当疾病发展状态的生物 标志物的可能性。本文的目的就是提供有关内皮细胞微粒（EMPs）在动脉粥样硬化过程中 发病机制的最新信息。1.什么是微粒？微粒（MPS）是细胞膜脱落的亚微米片段（0. 11mm）,其包含的信息有mRNA、 MICRORNAs、受体以及母细胞的特异蛋白，细胞应激

3、和细胞活化过程中会产生微粒。研 究表明，微粒（MPS ）是由血液中某些相关的细胞比如：内皮细胞、平滑肌细胞、血小板、红细胞以及白细胞的特异性表面蛋白释放的膜囊泡。一直以来，微粒（ MPS）都被视为细 胞垃圾或碎片”，因为对其形成的过程还未完全明确。不过，微粒（MPS）的形成和脱 落涉及到细胞膜磷脂结构的重组包括外小叶磷脂酰丝氨酸 （PS）及细胞结构的改变与细 胞骨架组织的破坏。几项研究报告指出小囊泡中存在类似微粒（MPS ）磷脂酰丝氨酸， 但不会在外部小叶暴露磷脂酰丝氨酸。各种临床试验和研究证实 MPs在糖尿病、肺癌、 中枢神经系统紊乱、炎症、全身红斑狼疮以及心血管疾病（心血管病）发挥着重要的

4、作 用，因此与MP相关的研究领域得以迅速发展。2微粒的类型表1总结了微粒的类型以及它们在疾病发展过程中的作用。表1:微粒的类型以及它们在疾病发展过程中的作用微粒在疾病发展过程中的作用参考文献PMP凝血、炎性过程、血栓形成、以及肿瘤形成19-21EMP内皮功能障碍、血管生成、肿瘤生长、促进氧化应激11, 22-24MMP内皮功能障碍、败血症、血管炎25-27PMP :血小板微粒；EMP :内皮细胞微粒；MMP :单核细胞微粒。3. 微粒的分离尽管一些研究者从合适的患者体内的血液中获得微粒（MP），但是这种方法所获 得的微粒数量极少，因此在实验研究过程中使用细胞因子、化学试剂或通过细胞凋亡诱 导等

5、刺激各种体外细胞（例如：Jurkat细胞和人脐静脉内皮细胞）来增加微粒的获得 量。各种诱导因子比如血管紧张素II、脂多糖以及过氧化氢都可以运用于体外刺激获得 生微粒（MP）。简单来说，通过适当刺激获得的微粒包含细胞悬浮液，通过低速离心 （1500xg）除去细胞，随后20,000xg下高速离心获得在离心管最底部的微粒。除去上 清液后，这些微粒（MP）悬浮于盐水缓冲溶液中，将其分离后于-70-80T保存，以备下一 步实验使用。另一方面，有些研究者将微粒进行超速离心（100,000x g）后使用。在这 种情况下，除了微粒其它直径在40-90nm脱落的囊泡也会沉淀在离心管底部。4. 什么是内皮微粒在人

6、体血液循环中，内皮微粒属于（EMPs）微粒（MP）家族中的一小群。它与血 管内皮功能障碍引起的心血管疾病的发生密切相关。研究表明，在血管再生过程中内皮 微粒（EMPs）的生长分裂以及内皮前体细胞的成熟对其发挥着有着重要的作用，这就 暗示着可能内皮微粒在血管再生、修复以及自我保护过程中扮演者非常重要的角色。所 以我们急切想了解在健康与病理条件下内皮微粒的水平差异。在这个方面，Mezentsev 等，通过实验来增加各种血管疾病的发生（细胞增殖率、毛细血管的形成以及内皮细胞 的死亡），体外测定健康志愿者的内皮微粒（EMPs）生理水平（103-104EMPs/ml）与 和患者的内皮微粒浓度（105EM

7、P/ mL）。高水平的内皮微粒（EMPs）能影响血管的生 成，其浓度与血管的生长速率呈现正相关的关系。由Koga等进行的另一项研究发现在 那些糖尿病患者或者患有冠状动脉疾病包括动脉粥样硬化等疾病的人，其体内循环中分 化簇的存在（CD ） 144也被称为血管内皮-（VE-）钙粘蛋白阳性具有较高的水平。所以, VE-钙粘蛋白阳性的EMPs可以作为一项指标来分析血管内皮细胞功能障碍引起的动脉 粥样硬化。因此，可以通过评估动脉粥样硬化病人血液中的 CD144-EMP水平来有效的 避免各种心脑血管并发症。5. 什么是动脉粥样硬化？动脉粥样硬化是血管炎性病症的一种，它是由于脂质、炎性细胞、血管平滑肌细胞

8、（VSMC）聚集以及血小板脂质过氧化引起内皮功能障碍，以此同时活化的巨噬细胞释 放炎症颗粒以及血管平滑肌细胞的迁移的和血管内膜层的增生导致血管内腔变窄所引 起的一种病症。它是由于内皮功能障碍，从而诱发血管内皮细胞产生趋化因子诱导单核 细胞聚集侵入新生的内膜层。在内膜上，单核细胞分化成巨噬细胞吞噬由病变部位流动 循环形成的氧化低密度脂蛋白（LDLs）从而导致炎症细胞的形成。动脉粥样硬化病变进 展可以加剧巨噬细胞聚集和各种炎症介质的释放，如环氧合酶-2（COX-2）、可诱导的 一氧化氮合酶（iNOS）、肿瘤坏死因子（TNF- a）和白细胞介素，其次是丝裂原活化蛋 白激酶（MAPKs ）通路激活，随

9、后产生胶原和病灶钙化从而导致血管平滑肌细胞向内膜 迁移和增殖。血小板和其他细胞循环的不断积累促进了动脉粥样硬化的形成，最终，小 动脉管腔狭窄进一步复杂化后引起致动脉管腔闭塞，形成动脉高血压从而形成动脉粥样 硬化的布鲁斯特斑块。在临床症状出现之前动脉粥样硬化已经发生，但是对于严重的临 床病患来说，早期识别动脉粥样硬化的形成是通过相应的措施来防止急性病症的进展， 由于成像技术不能用于早期的检测，并且也不能使用常规的技术来发现其血液循环中的 生物标记，这种生物标记对于预测心血管疾病的风险和病理改变有着非常重要的作用。6. EMPS在动脉粥样硬化发病机制中的作用表2总结了关于EMPs在动脉粥样硬化过程

10、中所起的作用的科学研究热点表2：与动脉粥样硬化相关联的微粒的科研工作微粒在动脉粥样硬化过程中所起的作用参考文献PMPS加强环氧合酶-2（COX-2 ）和细胞间黏附分子-1（ICAM-1 ）的释放；28蛋白激酶C（PKC）从细胞质向细胞膜转移的过程中COX-2在单核细胞中表达；29提高单核细胞对人的脐静脉内皮细胞的粘附；30通过P选择的表达增加白细胞的聚集和组装；31中性粒细胞聚集和增强细胞的吞噬活性。32empS阳性CD-144/血管内皮细胞钙粘蛋白；33活性氧（ROS）的形成；34基质金属蛋白酶-2（MMP-2）的活化和血管基质重塑；35, 36人体主动脉内皮细胞p38-MAPK表达的减少导

11、致诱发EMPs的TNF-a因子也随之减少；37EMPs在动脉粥样硬化斑中表现出TF活性；38E-选择素，ICAM-1和VCAM-1的表达。39mmpS诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的活化；40胞外信号调节激酶（ERK1 / 2）活化；41引起内皮功能障碍促凝物质；25IL-1 b的蛋白酶可增强血管炎性；42小鼠ApoE动脉粥样硬化斑块的形成；27心肌细胞中，细胞凋亡可以增加Bax和胱天蛋白酶-8， 胱天蛋白酶-3，以及色素C的表达；43诱导，炎性细胞因子的释放和激活 在单核细胞中诱导超氧阴离子生成和炎性细胞因子 NF-kB的释放和激活。446.1 EMPs与氧化激酶的联系Szotowski和V

12、ince等指出氧化激酶可以刺激EMPs的释放从而更进一步加快动脉 粥样硬化进程。Szotkowski等的研究已经找到活性氧离子（ROS）的形成与EMP相关 的组织因子的产生之间的关系的证据。此外，在使用电子辐射（ROS形成源）和TNF-a 诱导内皮细胞之前用抗氧化剂化合物提前处理能够明显的抑制ROS的形成。这种抑制伴随着血栓内皮微粒的低表达，这就表明了 ROS与血栓内皮微粒的形成具有正相关的 关系。由于氧气不足引起的代谢障碍导致细胞功能障碍最终由于代谢衰竭导致细胞凋 亡。凋亡是EMPs形成的一个强有力的信号。中性粒细胞通过各种途径结合于内皮表面 来上调内皮功能障碍和组织损伤，在这一点上，嗜中性

13、粒细胞的激活会引起各种负反应 比如ROS、细胞毒性酶、炎症媒介以及细胞因子的产生。此外，它还可以通过趋化来聚 集更多的中性粒细胞，并且嗜中性粒细胞和内皮细胞表面表达的糖蛋白可以增加它们在 血管内皮的粘附性。高水平的ROS可以干扰细胞的氧化平衡引起氧化应激以及破坏细 胞膜组织随后导致膜微粒的释放、蛋白质降解和细胞凋亡。6.2动脉粥样硬化中单核巨噬细胞产生的微粒（MPs）在动脉粥样硬化患者中，炎性巨噬细胞群在动脉粥样硬化斑中逐渐增大，单核巨噬细胞产生的MPs是不稳定粥样硬化斑块形成过程中很重要的一部分。在炎症活性因子（TNF-a，IL-1 b）和C反应蛋白刺激下单核巨噬细胞释放 MPs。此外，肉毒

14、素通过诱 导一氧化氮合酶（iNOS）的活化这一重要的路径来诱导单核巨噬细胞 MPs的释放。这 就成功建立了通过增加NO的生成来大量表达一氧化氮合酶（iNOS）从而更大的影响 血管炎的途经。此外，吸烟引起的单核凝血 MPs的增加需要依靠细胞外信号调节激酶（ERK1 / ERK2）的激活。在动脉粥样硬化过程中ERK的激活是引起血管平滑肌细胞增 殖的一种因素。MPs源于血管内皮功能障碍中含有促凝物质的单核细胞。Wang等所做 的一项研究表明，在单核巨噬细胞MPs中存在的IL-1 b可以增强血管炎性过程和激活内 皮细胞，同样，Hoyer等研究揭示了单核巨噬细胞微粒在动脉粥样硬化血管炎症过程 的作用，指

15、出在基因敲除ApoE小鼠中的粥样硬化斑块形成过程中单核细胞巨噬细胞微 粒的作用是它可以使细胞壁增厚，这项研究阐明在ApoE小鼠的动脉粥样硬化疾病行成 过程中，单核巨噬细胞微粒与血管炎症之间的相互作用。Milbank等指出，人类粥样硬 化斑块含有来自内各种坏死灶发生的细胞凋亡释放的微粒。以成年小鼠心肌细胞中巨噬 细胞（RAW264.7）来研究MPs的产生，结果表明，MPs含有TNF-a的可溶性形式， MPs可以增加细胞凋亡的表达调节因子，比如BCL-2样蛋白4（BAX）、胱天蛋白酶-8、 胱天蛋白酶-3、心肌细胞、细胞色素C等。以上这些结果表明，激活的巨噬细胞释放的 MPs所含有的TNF-a有助

16、于促进血管炎性信号的形成，从而导致动脉粥样硬化和心肌 梗死。6.3 .内皮微粒和基质金属蛋白酶在动脉粥样硬化中的联系许多研究普遍认为，微粒能诱导诱导金属蛋白酶 MMPs的表达，主要是通过其蛋白 水解活性降解细胞外基质ECM成分，而EMPs在纤溶酶定位和活化过程中发挥着重要 的作用（蛋白酶可以激活酶的活性）。除内皮细胞外的细胞产生的 MPs会影响MMP-2 和MMP-9的功能。动脉粥样硬化过程中，MMP-9和MMP-2通过降解细胞外基质和促 进血管平滑肌细胞转移到血管内膜来发挥其重要的作用。Lozito和Tuan指出内源性蛋 白酶通过表达两种膜型基质金属蛋白酶釉基质蛋白来增强 EMPs的活性，同

17、时认为可溶 性分子是维持ECM的关键，EMPs可激活内源性酶原MMP-2，但是还没有证据证明内 皮细胞分泌的因子可以使MP诱导的MMP-2、MMP-14生成。促使血管内皮细胞分泌 的因素包括细胞组织的浓度增加以及抑制金属蛋白酶-1（TIMP-1）和TIMP-2，使它们 在EMPs中检测不到。在血管生成和动脉粥样硬化过程中ECM的释放可以裂解蛋白酶， 尤其是内皮细胞释放的MMPs。Taraboletti等通过超微结构分析观察发现在体外培养 的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）其微粒大小在0.3-0.6mm。对微粒的进行详细分析后， 在微粒膜的外侧发现的MMP-2和MMP-9对粥样硬化的发展至关重要。

18、很显然，内皮 细胞通过各种方式刺激MMP-包含的微粒，这种方式主要是负责调节蛋白 MMPs的活 性来降解细胞外基质，从而促进在动脉粥样硬化内膜形成过程中 VSMC的迁移。6.4 EMPs与MAPKs信号通路的联系。MAPK是一种细胞信号传导途径，它与动脉粥样硬化病理生理学密切相关，因为它 能引起血管平滑肌细胞的增殖和迁移。MAPK是由三种蛋白组成的一个家族，即细胞外 信号调节激酶（ERK）、C-jun NH2末端激酶（JNK）和p38。先前的研究已经证明EMPs 的释放可以激活不同细胞的信号通路。体外实验已经表明，促炎介质可以引起内皮细胞 凋亡和活化，它主要是通过MAPKs依赖途径来增加EMP

19、s的释放，p38-MAPK途径参 与控制TNF-a依赖的EMPs释放。据观察发现，用治疗剂，使TNF-a诱导的EMPs减少 一半可以减少人主动脉中内皮细胞的p38-MAPK的表达。有趣的是，P38-MAPK途径 主要抑制MPs释放，这些发现揭示了 P38-MAPK信号在EMPs成熟过程强度很大并且 比较详细，它作为一个单向的模型，是EMPS形成的重要来源，而不是对EMPS产生反 应。同样地，它也提出了一种新的途径，通过p38直接抑制的EMP形成来来达到体内 的治疗效果。在生理学方面，在动脉粥样硬化的发展的早期，单核细胞中组织因子的代 谢旺盛。然而，在动脉粥样硬化后期阶段，TF因子的释放同样也受

20、巨噬细胞（泡沫细 胞）、内皮细胞和血管平滑肌细胞的监视。同样 TF因子也存在于动脉粥样硬化斑块的 坏死病灶中，与泡沫细胞、巨噬细胞以及淋巴细胞产生的 MPs密切相关。这些MPs可 以显示出粥样硬化斑块中 TF因子的活性。通过诱导内皮细胞中的TNF-a、IL-1 b、p38MAPKs和ERK等来促进细胞因子的释放，JNK参与TNF-a诱导的TF表达。6.5 EMPs诱导血管炎症目前EMP对血管炎症的影响从而更进一步导致动脉硬化已有详细的研究，许多的 研究倾向于MPs通过JNK1和NF-kB途径和单核细胞TNF-a和IL-1上调内皮细胞释放 的炎症介质比如IL-6、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1

21、）、可诱导的一氧化氮合酶（iNOS） 和环氧合酶-2（ COX-2）等。花生四烯酸，作为细胞损伤/炎症的标记物，由血小板产 生的MPs分泌，可以促进内皮细胞中COX-2和细胞内粘附分子-1（ICAM-1）的释放以 及通过蛋白激酶C（PKC）由胞浆向细胞膜的转移来促进单核细胞COX-2的表达。此外， 在MPs膜上的氨基磷脂可以加快炎症的形成，氨基磷脂作为磷脂酶A2的前体，负责催 化产生溶血磷脂酸（LPA），它是导致血管炎症发生的因素之一。凝血酶介导的炎症的颗粒如IL-8、白细胞介素-1受体拮抗剂（IL-素-1受体拮抗剂）和参与血液凝固、血管 炎症反应、和血管生成的IL-1都可以诱导EMPs的释放

22、。血管炎症反应与凝血是紧密相 连的两个过程，因为它们都导致了动脉血管壁的粥样硬化，并且在这个过程中，通过激 活NF-kB，促进氧化氮（NO）释放并增加氧化应激可以增强MPs的反应。科学证据表 明MPs可以通过炎性细胞因子的释放以及增加内皮细胞粘附分子的表达对血管造成功 能障碍。健康者血液循环中从白细胞（WBC）中获得的MPs处于低水平状态，而患有 血管炎症的则处于高水平状态。体外实验表明，这些MPs可以激活内皮细胞基因表达和释放炎症介质（IL-6和IL-8）和上调白细胞内皮因子CAM-1、血管粘附因子-1（VCAM-1）和E-selectin等。同样，伴随着血小板活化释放MPs，然后通过表达P

23、-selectin促进白细胞聚集和组装，进一步加深的炎症反应和动脉粥样硬化斑块的形成。 同样，血小板释放的MPs可以结合嗜中性粒细胞引起的中性粒细胞聚集和增强其吞噬 活性，这是血管炎症反应后我们所看到的非常普遍的一个现象。最近研究指出，单核细 胞氧化诱导应激标记物（超氧阴离子生产）、炎症细胞因子的释放和的单核细胞NF-kB 基因的激活需要MPs的参与。综上所诉，动脉粥样硬化过程中，MPs水平升高可能会 加剧炎症反应和血管损伤。6.6 MPs诱导细胞粘附因子研究已证实，EMPs从起源细胞携带许多的表面分子以增强自身的生理功能，常见 的如如分子类的细胞粘附分子其包括血小板内皮细胞粘附分子-1（ P

24、ECAM-1）、VCAM-1、 和ICAM-1等。动脉粥样硬化形成的关键步骤是通过这些细胞粘附分子介导的循环单核 细胞在血管内皮附着。某研究表明，MPs和血小板集外来体可以增强内皮细胞的ICAM-1 和单核细胞U937细胞对人脐静脉内皮细胞的粘附能力。对损伤或者凋亡或活化的内皮 细胞进行刺激，其产生的表面抗原分子EMPs是多种多样的。Jimenez等研究表明从诱 导的内皮细胞获得EMPs的表面抗原E-selection、ICAM-1和VCAM-1数量增加，而诱 导凋亡的内皮细胞获得的EMPs的这些表面抗原数量减少。此外，用ECs诱导获得EMPs 的VE-钙粘蛋白、PECAM-1和内皮糖蛋白的水

25、平较低，同样体外试验获得 MPs也诱导 细胞粘附分子的表达，尤其是在内皮细胞表面上ICAM-1因子。同样，在人体内的研究 中，从人体粥样硬化斑块分离的 MPs可以增强内皮细胞因子ICAM-1的表达，其随着 单核细胞附着到血管内膜层，但是从血浆获得 MPs却没有这种功能。粥样硬化斑块中 的MPs可以提示磷脂依赖性途径细胞粘附因子从 MPs到内皮细胞的转运过程中内皮细胞因子ICAM-1活性增强的机制。粥样硬化斑块MPs在炎症细胞通过ICAM-1介导召集 中的作用是运用于动脉粥样硬化病变过程度水平较低的时候。相对于血管内皮细胞，新 生内膜表达的VCAMs较高。这些不寻常的新生血管功能是由于血管随机分

26、支决定的， 其中包括不成熟的内皮细胞渗透性改变而成。基于这个原因，粥样硬化斑块MPs的ICAM-1可随血流分散，因此内皮细胞的的表面随身携带可以旁分泌”ICAM-1的分泌 器。7. EMPs与动脉粥样硬化疾病的临床联系许多疾病类似肥胖和更年期等生理条件下都与循环 MPs以及动脉粥样硬化有着密 切的关系。处于更年期的妇女，内源性雌激素水平的减少会有血管炎的风险，正常水平 的内源性雌激素有助于抗炎、抗凝血剂、内皮细胞抗血栓等。其背后的机制包括平衡 NO产生、降低氧化应激、降低凝血细胞粘附分子的表达等。对于更年期的妇女来说， 高水平的细胞MPs和促炎性细胞因子可以导致白细胞因子和血小板粘附内皮表面的

27、粘 附能力的变化，从而发展成内膜增厚和血管病变。因此，更年期的妇女很可能成为代谢 综合征（心血管疾病）的高危人群。MutHUVEL，Jayachandran等对最近更年期妇女特 别是血小板特定功能及细胞膜产生的 MPS中的个别MP水平的调查中推测血小板功能 的改变，以及从早期更年期患者血液和血管细胞获得的 MPs水平的改变以发现早期动 脉粥样硬化。在细胞水平上，这些改变明确指出更年期如何有助于 MS形成最终导致心 血管疾病，包括动脉粥样硬化。肥胖症和2型糖尿病患者增加了动脉粥样硬化等并发症 的风险，因为肥胖以及个别抗胰岛素的个体血浆中的 MPs含量升高。体内研究完成的 74个全膝关节置换术的病

28、人中，肥胖患者其MPs水平更高。因为手术后MPs水平明显 上升，除了肥胖的病人，在术后3天，其EMPs水平恢复至手术前。此外，肥胖患者的 内皮祖细胞很少，而手术后脂肪因子水平升高。这表明血在管炎性疾病的状态下，手术 后会使脂肪因子水平增加并且内皮细胞的修复能力下降。通过建立动物模型即长时间高 热量鼠粮（HFD）喂养大鼠，使他们肥胖和抗胰岛素，增加血管内皮功能障碍以及上调 炎症介质的释放来研究MPs促进动脉血管粥样硬化的各种途径。Heinrich等发现，高 脂鼠粮喂养大鼠与普通鼠粮喂养大鼠想比较，前者总的 MPs水平提高了。在这项研究 中，从内皮细胞、白细胞和血小板获得的 MPs水平显著提高了，

29、从HFD喂养大鼠分离 得到的MPs具有刺激ROS产生以及作为MPs炎性指标VCAM-1表达的能力。8. 结论通过动脉粥样硬化过程中各种途径的激活引起内皮微粒的释放，其中最重要的是氧 化应激、内源性分子（TGF- a、PDGF和白细胞介素）以及细胞凋亡等，血液中 MPs功 能的改变最终导致动脉粥样硬化的病理变化。值得一提的是，各种生理和病理状态比如 更年期、肥胖和糖尿病等都可以通过产生 MPs而促使动脉硬化形成。此外，单核巨噬 细胞产生的MPs也是不稳定粥样硬化斑块形成的重要组成部分。因此，通过药物治疗 下调EMPs以及其他抑制MPs释放的途经，都可以作为治疗血管炎性疾病如动脉粥样 硬化的一种选择。