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1、16S rRNA 序列分析探讨肠道菌群与抑郁伴消化道症状患者的中医证候关系重度抑郁障碍 (Major Depressive Disorder,MDD),即抑郁症 , 是以心境障碍为主要特征的一种综合征。 世界卫生组织预测 , 抑郁症将在 2020 年成为人类死亡与致残的第二大原因 , 成为全球医疗健康体系待解决的最大难题之一。迄今为止 , 抑郁症发病机制尚不明确。而近几年, 越来越多的研究表明 , 肠道微生物作为人体最大、最直接的外环境, 拥有大约 10 万亿个细菌 , 相当于人体细胞数量的 9 倍、基因数量的 150 倍, 可通过“微生物 - 肠 - 脑”轴影响脑功能与行为 , 导致抑郁的发
2、生。因此 , 预防抑郁症发病、讨论发病机制、探索有效治疗方案的研究至关重要、迫在眉睫。研究目的及意义 : 以抑郁伴消化道症状患者为研究对象, 采用 16S rRNA基因测序方法 , 比较中医不同证型 ( 肝郁脾虚证与肝胆湿热证) 患者粪便中肠道微生物群落的组成 , 评估其是否发生显著性改变, 异同菌种特点及关系 , 从而为抑郁症提供新的中医辨证角度、提高辨证施治的水平, 完善“微生物 - 肠- 脑”轴与中医理论关系 , 为进一步深入探讨“证候- 中药 - 微生物”及个体化肠道管理奠定基础。研究方法 : 选取研究对象 :2018 年 1 月-2018 年 12 月间前来北京中医药大学东方医院脑病
3、二科就诊求治的符合纳入及排除标准的抑郁症患者及健康人群, 抑郁症患者证型选择消化道症状较明显的肝郁脾虚15 例、肝胆湿热 15 例; 问卷填写 : 签署相关知情同意书 , 收集三组研究对象的个人基本信息 , 进行汉密尔顿抑郁量表、抑郁症中医证候观察表评定 ; 标本采集 : 收集研究对象粪便标本 , 并迅速将标本冻存在 -80 冰箱内 , 以便后续实验。测序实验: 利用 Miseq 测序方法将抽提的 16S rRNA 基因组 DNA片段合成带有 barcode 的特异引物进行 PCR扩增 , 并将PCR产物用 QuantiFluorTM-ST 蓝色荧光定量系统进行检测定量, 最后构建 Miseq
4、文库并进行测序。研究结果 :(1) 一般资料 : 研究对象的年龄分布主要集中在31-50 岁之间 , 男女比例约 1:1, 职业多为白领、学生和教师 , 文化程度多为本科及以上。 (2) 主诉、其他症状及病程 : 大多数患者病程1-2 年;90%患者以失眠为主诉 ;100%患者存在悲观失望、多思善虑、自卑绝望; 另外纳差 (70%,肝郁脾虚 50%、肝胆湿热 20%)、善饥 (30%)、便溏 (40%,肝郁脾虚 40%)、便秘 (50%,肝郁脾虚约 3%、肝胆湿热约47%)。(3) 量表情况 : 患者全部属于轻中度抑郁症 , 汉密尔顿抑郁量表评分均大于20 分, 小于 35 分 ;4 例肝郁脾
5、虚证患者汉密尔顿焦虑量表评分大于13 分小于 21分 ,8 例肝郁脾虚证患者及6 例肝胆湿热证患者汉密尔顿焦虑量表评分大于7 分小于 13 分。肝郁脾虚证患者的汉密尔顿焦虑量表评分平均分明显高于肝胆湿热证患者。(4) 舌脉象情况 : 肝郁脾虚证患者多为舌淡红、苔薄白、舌形适中、边齿痕,脉弦滑细 ; 肝胆湿热证患者多为舌红、苔黄腻、或薄或厚、舌形适中、边齿痕或有裂纹 , 脉弦滑数。 (5) 菌群结构情况 : 从 35 例患者的粪便样本中抽取DNA,我们共获得 248980 个高质量的 16S rRNA基因序列 (7064 2350 读取 / 粪便样本 ), 之后在 97%阈值的相似性水平上被分为
6、操作分类单元(OTUs)。这些操作分类单元 (OTUs)全部被归至细菌界。在门(Phylum) 的水平上 , 绝大多数属于以下两个门 : 拟杆菌门 (Bacteroidetes)和厚壁菌门 (Fimicutis)。其中空白对照组拟杆菌门丰度约54.94%6.12%(x s), 厚壁菌门丰度约为43.95% 6.53%, 肝胆湿热证患者 , 拟杆菌门丰度约为50.05%7.01%, 厚壁菌门丰度约为 47.45%8.63%, 变形菌门 (Proteobacteria)丰度约为 1.48%0.12%,肝郁脾虚证患者 , 拟杆菌门丰度约为53.56%6.65%(x 士 s), 厚壁菌门丰度约为44.
7、96% 7.81%, 变形菌门丰度约为1.46%0.13%。在科 (Family) 的水平上 , 肝胆湿热证患者乳杆菌科 (Lactobacillaceae)、优杆菌科 (Eubacteriaceae)、链球菌科 (Streptococcaceae)、韦荣氏菌科 (Veillonellaceae)、理研菌科(Rikenellaceae)、产碱菌科 (Alcaligenaceae)、伯克氏菌科 (Burkholderiaceae)、肠杆菌科 (Enterobacteriaceae)比例高于肝郁脾虚证患者, 而毛螺菌科(Lachnospiraceae)、拟杆菌科 (Bacteroides)、紫单胞
8、菌科(Porphyromonadaceae) 、普雷沃氏菌科 (Prevotellaceae)比例低于此类患者。在属的水平上 , 肝胆湿热证患者乳杆菌属(Lactobacillus)、优杆菌属(Eubacterium) 、链球菌属 (Streptococcus)、韦荣氏菌属 (Veillonella)、氨基酸球菌属 (Acidaminococcus) 、考拉杆菌属 (Phascolarctobacterium)、理研菌属(Rikenella)、伯克氏菌属 (Burkholderia)、埃希氏菌属 (Escherichia)、Sutterella、Megamonas比例高于肝郁脾虚证患者, 而拟
9、杆菌属 (Bacteroides)、卟啉单胞菌属 (Porphyromonas) 、普雷沃氏菌属 (Prevotella)、粪球菌属(Coprococcus) 、瘤胃球菌属 (Ruminococcus) 比例低于此类患者。 (6) 菌群多样性情况 : 菌群的 a 多样性 Shannon指数、Simpson 指数 , 肝胆湿热证患者大于肝郁脾虚证患者 ( 但 P>0.05),没有统计学意义。进一步利用 Unweighted Unifrac距离矩阵研究肠道菌群的多样性, 发现两组患者主成分间存在差异。 进一步分析性别、 年龄、病程等分类变量没有显著影响。(7) 肠道菌群的丰度与舌象的关联性分
10、析 , 发现舌红、苔黄厚腻患者与舌淡红、苔薄白患者存在差异 ; 肠道菌群的丰度与脉象的关联性分析 , 发现弦脉患者粪球菌属较非弦脉患者高 , 而埃希氏菌属较低 ; 滑脉患者埃希氏菌属韦荣氏菌属、 氨基酸球菌属较非滑脉患者高。研究结论 :(1) 抑郁症患者人群多为脑力工作者 , 文化程度较高 , 并呈年轻化趋势 ; 就诊时主诉多为失眠 , 伴悲观失望、多思善虑、自卑绝望 , 病程一般为 1-2 年, 病情多数为轻中度。(2) 全部患者均有消化道症状 , 但由于证型不同其表现不同。 肝胆湿热证患者与肝郁脾虚证患者症状上最大区别为大便性质、 是否纳差、舌脉情况及抑郁程度。肝胆湿热证患者多便秘、无纳差
11、、舌红苔黄腻、中度抑郁发作; 肝郁脾虚证患者多便溏、纳差、舌淡红苔薄白边齿痕、轻度抑郁发作。(3) 肝胆湿热证患者与肝郁脾虚证患者相比,a多样性无差异, 多样性存在明显差异, 结构存在差异;结构差异主要为拟杆菌门、厚壁菌门及变形菌门丰度改变的程度, 并总结出抑郁症临床症状的有无、 轻重 , 与肠道菌群群落丰度、 多样性的改变关系密切 , 不同证型患者肠道菌群的主要菌门改变趋势大致相同, 但改变程度不同。(4) 用中医整体观念理论验证“微生物 - 肠 - 脑”轴且不同舌象、不同脉象 ,其肠道菌群丰度不同 , 所代表意义不同 , 或验证了中医“舌为心之苗 , 苔为胃之根”理论的科学性 , 促进中医理论对现代医学知识的吸纳。
SrRNA序列分析探讨肠道菌群与抑郁伴消化道症状患者的中医证候关系
