戴安离子色谱及液相色谱在奶制品检测中

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1、 戴安中国有限公司 目 录离子色谱法及液相色谱法同时检测奶制品中三聚氰胺和三聚氰酸 . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2离子色谱法（等度法、梯度法） . 2液相色谱法（C18分析柱法、CS10分析柱法） . 4液相色谱/质谱法 . 5离子色谱法检测奶粉和奶制品中的硝酸盐及亚硝酸盐. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8奶制品中的有机阳离子、胆碱、乙酰胆碱以及乌拉胆碱的分析 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10离子色谱检测奶制品中的微量碘

2、. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11牛奶中硫氰酸根的测定 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12牛奶中高氯酸盐的测定 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

3、. . . . . . . 13牛奶中羟脯氨酸的测定 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15牛奶中三价铬和六价铬的测定. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 171 三聚氰胺，简称三胺, 学名三氨三嗪, 别名蜜胺、氰尿酰胺、三聚酰胺, 是一种重要的氮杂环有机化工原料, 具有一定的肾毒性。因

4、为其分子中含有大量氮元素（大约66%），而用全氮法检测蛋白质含量时不能够区分这种“伪蛋白氮”, 所以一些不法乳制品厂家或无良的奶农，为了追求最大利益而不顾消费者的生命健康和安危，向产品中大量添加三聚氰胺粉以提高“蛋白质”含量。三聚氰酸与三聚氰胺结构类似，在化工生产过程中经常同时存在。因此，如果在奶粉生产过程中直接加入化工原料三聚氰胺，事实上也同时掺入了混在三聚氰胺当中的三聚氰酸，当三聚氰胺和三聚氰酸同时存在时，分子结构上的氢氧基与氨基之间会形成水合键，将二者连接起来，形成网格结构，当混在奶粉中的这种网格结构被摄入人体后，由于胃酸的作用，三聚氰胺和三聚氰酸相互解离，分别被吸收入血液，并被运送到肾

5、脏，准备随尿液排出体外，但在肾脏细胞中，两种物质又一次相遇，再次结合成网格结构-不溶于水的大分子复合物-并沉积下来，形成结石，结果造成肾小管的物理阻塞，导致尿液无法顺利排除，使肾脏积水，最终导致肾脏衰竭。婴幼儿由于主要营养来源来自于奶粉，而一旦大量食用含有三聚氰胺和三聚氰酸的奶粉，会形成肾结石，长期摄入会造成肾衰竭和死亡。成年人长期摄入三聚氰胺和三聚氰酸，也会造成不同程度的肾损伤，因此，无论从任何层面上讲，三聚氰胺和三聚氰酸都应该被严令禁止加入到任何食品中。据2007年6月的美国兽医学会杂志报道，2007年3月中旬以来，美国发生4000多起猫、狗等宠物中毒死亡事件。美国食品药品管理局（FDA

6、）从进口的部分小麦蛋白粉和大米蛋白粉中检出三聚氰胺等成分。调查结果认为：掺杂了6.6%三聚氰胺的小麦蛋白粉是导致宠物食品中毒的祸端。2008年9月由于多例婴幼儿因饮用奶粉发生肾结石而爆发的奶粉掺有三聚氰胺事件，引起中国政府的极度重视，开始对牛奶及奶制品进行大规模监查。目前三聚氰胺的检测方法主要集中在色谱或色谱与质谱联用技术上。目前文献报道过的方法包括GC-MS 方法，离子对试剂液相色谱-紫外检测法，LC-MS 法和LC-MS/MS法等，但是上述各种方法都或多或少存在一些缺陷。本资料为您介绍快速准确检测三聚氰胺的方法 离子色谱法和液相色谱/质谱法。离子色谱法本法是采用阳离子交换离子色谱-紫外检测

7、的技术，对奶粉中三聚氰胺进行了准确定量，戴安公司为您提供等度以及梯度两种测定方法，为三聚氰胺的测定提供可靠的保障。奶粉及液态奶样品前处理方法：奶粉一、奶粉：（使用RP 柱前处理，进样体积100微升） 称取1.00 g 奶粉样品，充分溶解于4mL 去离子水中。 使用色谱纯乙腈定容至10mL, 充分混匀。 室温沉降蛋白十分钟。 取上清液，使用去离子水稀释十倍，依次过0.22微米尼龙滤头和活化过的RP 柱。 准备进样分析。二、奶粉：（使用NG1在线前处理，进样体积10微升） 称取1.00 g 奶粉样品，充分溶解于4mL 去离子水中。 使用色谱纯乙腈定容至10mL, 充分混匀。 室温沉降蛋白十分钟。

8、取上清液，过0.22微米尼龙滤头。三聚氰胺和三聚氰酸2 准备进样分析。（由于在定量环后，保护柱前，加一个可以去除疏水性组分的NG1柱，乙腈已将绝大部分蛋白沉淀，而残余的蛋白及脂肪则可被NG1小柱去除。）液态奶一、液态奶：（使用RP 柱前处理，进样体积100微升） 取4mL 牛奶样品。 加入5mL 色谱纯乙腈, 充分混匀。 室温沉降蛋白十分钟。 取上清液，使用去离子水稀释十倍，依次过0.22微米尼龙滤头和活化过的RP 柱。 准备进样分析。二、液态奶：（使用NG1在线前处理，进样体积10微升） 取4mL 牛奶样品。 加入5mL 色谱纯乙腈, 充分混匀。 室温沉降蛋白十分钟。 取上清液，过0.22微

9、米尼龙滤头。 准备进样分析。（由于在定量环后，保护柱前，加一个可以去除疏水性组分的NG1保护柱，乙腈已将绝大部分蛋白沉淀，而残余的蛋白及脂肪则可被NG1小柱去除。）注：使用NG1时，在NG1柱前串接200微升体积的一段绿管，用于样品与流动相预混合。每折合进样100针，应使用80%乙腈对NG1进行清洗，前后用水过度。方法一：等度法测定奶粉及奶制品中的三聚氰胺测试对象：奶粉、生鲜牛奶，本方法最低检出限为0.06 mg/Kg（液态奶）或者0.1 mg/Kg（奶粉样品），样品加标回收率为85%-105%，实际样品重现性RSD 小于4%。仪器准备：戴安公司离子色谱 紫外检测器色谱条件： 淋洗液：MSA

10、（6 mmol/L）或硫酸（3 mmol/L）等度 色谱柱：CS17色谱柱 + CG17保护柱 柱温：30 进样体积：10 L 检测器：紫外检测器UV ，240 nm分析时间：12 min35 mg/L三聚氰胺，出峰时间8.5min 左右2.004.006.009.50-0. 500.501 - 三聚氰胺mAUmin阳性牛奶样品， 三聚氰胺浓度67.2 mg/kg2.009.500.501 - 三聚氰胺mAUmin4.006.008.001.001.501.808.000. 001.001.502.002.503.003.50-0.200.00离子色谱法及液相色谱法同时检测奶制品中三聚氰胺和三

11、聚氰酸10 ppm 三聚氰胺标准溶液色谱图，13.5分钟左右出峰三聚氰胺阳性样品色谱图4色谱峰：三聚氰胺 131 mg/kg5.010.015.0min501001502001 - 三聚氰胺 - 13.487mAU5.010.015.019.00204060801001201 - 三聚氰胺 - 13.480mAUmin 液相色谱法戴安也为您提供液相色谱检测三聚氰胺的方法，方法都与国家标准相符。方法一：样品前处理：与原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法（GB/T 223882008）方法一致色谱条件:流动相： 10mM的庚烷磺酸钠与柠檬酸（10 mM）缓冲溶液：乙睛92：8检测波长：240 nm色谱

12、柱：Dionex Acclaim 120，C18，5 m，120A ，4.6250mm 仪器：Dionex U3000 高效液相色谱仪Pump ：LPG 3400低压四元梯度泵，内置真空脱气机AutoSampler: WPS-3000ColumnOven: TCC-3000Detector ： DAD-3000二极管阵列检测器该方法三聚氰胺约11 min出峰，方法检测限是0.29 ppm方法二：梯度法测定奶粉及奶制品中的三聚氰胺测试对象：奶粉、生鲜牛奶、液态奶、巧克力豆、奶糖、饼干等，本方法最低检出限为0.03 mg/Kg（液态奶）或者0.05 mg/Kg（奶粉样品），样品加标回收率为77-1

13、21%，实际样品重现性RSD 小于4%，结果令人满意。仪器准备：仪器：戴安公司离子色谱 紫外检测器色谱条件： 淋洗液：MSA 梯度或硫酸梯度 色谱柱：CS17色谱柱 + CG17保护柱 柱温：30 进样体积：25 L检测器：紫外检测器，240 nm 方法二：样品前处理：与原料乳中三聚氰胺快速检测 液相色谱法 （GB/T22400-2008）方法完全一致方法条件： 实验仪器：戴安U3000液相色谱或戴安离子色谱 检测器：紫外检测器 色谱柱：IONPAC CS10分析柱流动相：磷酸盐缓冲溶液 - 乙腈（70+30，体积比），混匀。（磷酸盐缓冲液：0.05 mol/L。称取6.8 g磷 酸二氢钾（准

14、确至0.01 g），加水800 mL完全溶解后，用磷酸调节pH 至3.0，用水稀释至1 L，用滤膜（水相，0.45 m）过滤。） 流速：1.5 mL/min 检测波长：240 nm 进样量：25 L最低检出限：0.06 mg/kg(样品稀释一百倍后进样，计算检出限为0.6 ppb浓度为10 ppm 的三聚氰胺标准品色谱图，进样量20 L0.010.020.0-10.01 - 三聚氰胺 - 11.073mAUmin15.00. 020.040.060.080.05.0加标样品色谱图，三聚氰胺与样品中的杂质均能被基线分离，最大限度的将杂质引起的误差降到最低0.010.020.0-2.03 - 三聚

15、氰胺 - 11.043mAUmin15.00. 05.010.015.020.05.01- 2- 11.6835- 14.1232 ppm 标准品谱图0.010.0-10.01 - 三聚氰胺 - 5.713mAU min15.00. 05.020.030.040.05.0-5. 010.015.025.035.0 稀释100倍样品谱图检测含量：6.825 ppb0.010.0-3.91 - 三聚氰胺 - 5.760mAUmin 15.00. 03.06.09.012.55.0-3.0液相色谱/质谱法特点：使用戴安公司最新开发的混合基质柱WAX-1分离被分析物。该色谱柱利用疏水和离子交换混合作用

16、机理来达到特殊的选择性和保留。液相色谱运行时间仅用8分钟，戴安公司的MSQ 质谱检测器确保选择性和灵敏度。对于两种物质（2-200 ng/mL）的线性都能达到R 20.9995。方法检出限（MDL ），三聚氰胺为3.97 ng/mL，三聚氰酸为3.32 ng/mL。本检测条件下MSQ 质谱检测器的检出限=98.0%，精密称取0.1422g ，去离子水定容至1000ppm ，分别稀释至10ppm 、100ppb ，再依次稀释分别配制得到标准工作溶液5、2.5、1、0.5、0.25、0.1、0.05 ppb ClO4。色谱柱：IonPac AS20 2250mm 分析柱， IonPac AG20

17、250mm 保护柱淋洗液组成：EG-KOH ，0-17min ，40mM ；17-22min ，70mM ，22-27min ，40mM （带CR-ATC ）流速：0.25mL/min抑制器：连续自动再生膜阴离子抑制器检测器：电导检测器质谱参数： Probe Voltage: -3KV; Cone Voltage: 70V; Probe Temp: 450; SIM channels, 99,101,m/z; SIM parameters; Span 0.3amu;Dwell time: 1s0.02.04.06.08.010.012.014.016.018.020.0-5,000010,00

18、020,00030,00010.0520.130.240.551.04321 - Perchlorate98.84-99.15 m/z16.01,0002,5003,7505,0006,2507,5008,75010,0002gu+40ppbcounts2198.84-99.15 m/z1gu+3测定标准溶液色谱叠加图：5、2.5、1、0.5、0.25、0.1、0.05 ppb ClO4-标准溶液色谱叠加图某奶粉样品测定及加标谱图02.04.06.08.010.012.014.016.018.020.0-5,000010,00020,00030,00010.0520.130.240.551.0

19、2.0min65432198.84-99.15 m/z0.02.04.06.08.010.012.014.016.018.020.01,0002,5003,7505,0006,2507,5008,75010,0002gu+40ppbcounts298.84-99.15 m/z1gu+3牛奶中高氯酸盐的测定牛奶中羟脯氨酸的测定 动物胶原水解蛋白是一种廉价蛋白原料，是将牛皮及其制品下脚料等成分粗加工后制成的水解蛋白质， 某些非法厂家在乳粉中掺入廉价的水解动物蛋白来冒充或替代乳蛋白质，提高乳中蛋白的质量分数，降低成 本。掺加动物胶原水解蛋白不但会影响乳的口感和风味，改变牛乳的溶解度，因其氨基酸的组成

20、不合理， 且不易消化，所以营养价值低下，导致人体吸收利用率降低，会严重影响消费者的健康状况。而羟脯氨酸 (Hydroxyproline, Hyp 又名反式-4-羟基-L-脯氨酸，为胶原蛋白中的特有氨基酸，其含量占10%以上；而乳蛋白 中不含有此成分，如若样品中检测出来含有L(-羟脯氨酸，可判定添加了动物水解蛋白。 戴安公司提供羟脯氨酸的测定方法，为乳制品中是否掺入动物胶原水解蛋白的判断提供依据。 样品前处理方法： 前处理方法参考GB/T 18246-2000 饲料中氨基酸的测定 ： 将适量样品（奶粉或者牛奶）到安培瓶中，加入 6 mol/L 盐酸溶液 10mL ，液氮冷冻，抽真空，在酒精喷灯

21、上烧结瓶口，于 (110 士 1 恒温干燥箱中水解 22 h 。冷却后，混匀，开管，用移液管吸取 200 L 滤液，置浓缩 仪或旋转蒸发仪中蒸发至干。加入3 mL 0.02 mol/L盐酸和20 mg/L叠氮化钠混合溶液，摇匀后备用。 测定前，取适量该样品溶液，以20 mg/L叠氮化钠溶液稀释至10 mL，摇匀后通过0.22m尼龙滤膜和OnGuard RP柱（1 cc，经甲醇和水活化），弃去初始3 mL后收集1mL流出液，直接进样分析。 色谱条件 仪器型号：ICS-3000 色谱柱类型尺寸 分析柱：AminoPac PA10，2502mm 保护柱：AminoPac PA10G，502mm 检测

22、方式：脉冲积分安培检测，Au电极，氨基酸检测电位，pH参比电极模式 淋洗液组成：NaOH/NaOAc/HOAc梯度淋洗： AminoPac PA10使用说明中Table 3 Gradient Conditions for Amino Acids and Carbohydrates 添加42.2-44.2min，0.1 mol/L HOAc冲洗步骤，其余同 流速：0.25 mLmin 进样体积：25 L 10 mol/L 羟脯氨酸标准溶液分离谱图： 200 nC 1 - Hydroxyproline 10 m HP 150 100 50 -20 min 0.0 5.0 10.0 15.0 20.

23、0 25.0 30.0 35.0 40.0 15 400 nC 10um 19aa 基线分离。 -40 100 200 300 400 -20 100 150 200 -20 50 0.0 0.0 奶粉样品水解液的分离谱图 10 mol/L 19AA标准溶液分离谱图： 0.0 nC nC 1 - Arginine 2 - Glutamine 3 - Lysine 5.0 5.0 5.0 10.0 10.0 10.0 1 - H yd ro xyp ro lin e 4 - Alanine 5 - Threonine 6 - Glycine 7 - Valine 8 - Hydroxyproli

24、ne - Serine 10 -9Proline 11 - Isoleucine 12 - Leucine 13 - Methionine 15.0 15.0 15.0 10um 19aa 由标准谱图可见，羟脯氨酸与另外常见 18 种氨基酸可以实现较好的分离，与相距较近的丝氨酸也可以实现 16 20.0 25.0 30.0 35.0 min 40.0 20.0 20.0 25.0 14 - Histidine 15 - Phenylalanine 16 - Glutamate 17 - Aspartate 25.0 30.0 35.0 30.0 18 - Cystine 19 - Tyrosi

25、ne 35.0 min min 40.0 40.0 牛奶中羟脯氨酸的测定 牛奶中三价铬和六价铬的测定 某些非法厂家在乳粉中掺入廉价的水解动物蛋白来冒充或替代乳蛋白质，提高乳中蛋白的质量分数，降低 成本，而这些水解动物蛋白是将牛皮及其制品下脚料等成分粗加工后制成的水解蛋白质，由于制革过程中需 要大量的三价铬作为铬鞣剂，因此皮革水解蛋白即使经过脱铬处理也会存在一定量的重金属铬。这些铬主要 以 Cr(III 和 Cr(VI 的形态存在，六价铬具有很强的毒性，可干扰重要的酶体系，具有致癌和诱发基因突变的作 用。三价铬是人体的一种必需微量元素，在正常食品补给剂量下，三价铬是无毒的，但较高剂量的三价铬仍表

26、 现出细胞毒性反应，因此对于含“皮革水解蛋白粉”的乳制品，同时检测其中三价铬和六价铬的含量具有重要 意义。 原子吸收和发射光谱等方法只能检测铬的总量；直接分光光度法检测时两种铬精确度难以保证。有文献报 道用离子色谱分离， UV 或电感耦合等离子体质谱同时检测三价铬和六价铬，用 UV 检测的方法中六价铬没有经 过络合，因而灵敏度较低。戴安公司采用离子色谱法对三价铬和六价铬分别进行柱前和柱后衍生，大大提高了 检测灵敏度，六价铬的检测限与使用ICP-MS检测接近，而仪器设备成本大大降低。 本文采用带有 pH 缓冲体系和三价铬络合剂的溶液完成了两种铬的同时提取，并且提取、沉降蛋白、柱前衍 生同时完成，

27、使前处理步骤大大减少。 色谱条件 色谱柱：IonPac CS5A 4mm250mm分析柱及IonPac CG5A 4mm50mm保护柱； 淋洗液：2 mM PDCA，2 mM Na2HPO4，10 mM NaI，50 mM CH3CO2NH4，2.8 mM LiOH混合水溶液； 衍生试剂：2 mM DPC，10 %(V/V甲醇，2.5%(V/V硫酸。 淋洗液流速：1.0mL/min；衍生液流速：0.5 mL/min。 检测波长：04.3min 365 nm，4.38min 530 nm。 仪器： ICS-3000 离子色谱仪（ Dionex ，美国）； Ultimate 3000 可变波长紫外

28、可见检测器； PC-10 柱后衍生 装置；375 L编结反应管；OnGuard II RP前处理柱（1.0cc）；0.22 m尼龙滤膜。 样品溶液的制备 在一个 50mL 容量瓶中，按顺序加入牛奶或牛奶加标样品 0.5mL ，超纯水 4.5mL ，淋洗液储备液 5mL ， 33% 硝酸0.1mL, 煮沸2-3分钟，冷却定容后过0.22 m尼龙滤膜和OnGuard II RP前处理柱，弃去前面3mL，后面溶液 用于进样。 方法利用吡啶二羧酸铬（ CrIII-PDCA ）的紫外吸收和二苯卡巴肼铬（ CrVI-DPC ）在可见光区的吸收来进 行检测。由于三价铬的配位交换的动力较弱，所以需要进行柱前衍

29、生生成 Cr(III-PDCA ，进样后在分析柱中以 Cr(PDCA 2-的形式被分离，而六价铬则以铬酸根离子（ CrO 42）的形式被分离出来。在分离之后再采用柱后衍 生生成 Cr(VI-DPC ，两种物质在不同波长下进行检测。两种铬的标准品分离谱图和牛奶加标样品分离谱图见图 1和图2。由图2可见，牛奶基体对两种铬的检测都没有干扰，分析快速准确。 18.0 mAU 16.0 14.0 12.0 10.0 8.0 6.0 4.0 2.0 0.0 -3.0 0.00 min 8.00 1 - Cr 2 - Cr WVL:365 nm 25.0 mAU 22.5 20.0 17.5 15.0 12

30、.5 10.0 7.5 5.0 2.5 0.0 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 -3.0 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 min 8.00 1 - Cr 2 - Cr WVL:365 nm 图1. 三价铬和六价铬标准品分离谱图 图2. 牛奶加标样品分离谱图 17 戴安中国有限公司 香港总部 香港新界葵涌兴芳路223号 新都会广场1座16楼1618-1619室 电话：（852）24283282 传真：（852）24287898 E-mail：dionex.hk 北京代表处 北京市朝阳区安定路33号 化信大厦A座

31、606室 邮编：100029 电话：（010）64436740 （010）64436741 传真：（010）64432350 E-mail：beijing 上海代表处/维修站 上海淮海中路1号 柳林大厦2311室 邮编：200021 电话：（021）63735493 （021）63735348 传真：（021）63848294 E-mail：shanghai 应用研究中心 北京市海淀区双清路18号 中科院生态环境中心 邮编：100085 电话：（010）62849182 传真：（010）62849239 E-mail：Dionex_App 维修服务中心 北京市朝阳区安定路33号 化信大厦A座6

32、06室 邮编：100029 电话：（010）64436740 （010）62936510 传真：（010）62923552 E-mail：service 广州联络处/维修站 广州市天河区天府路237号 华建大厦C座906室 邮编：510630 电话：（020）88316797/39442165 传真：（020）85613258 E-mail：penghong 成都联络处/维修站 四川省成都市顺城大街308号 冠城广场8楼F座 邮编：610017 电话：（028）86528208 传真：（028）86528204 E-mail：chengdu 戴安公司客户服务专线： 400-610-0104 中

33、文网址： Dionex products are designed,developed, and manufactured under an ISO 9001 Quality System. 2006 Dionex Corporation Analyst is a registered trademark of Applied Biosystems. Hystar is a trademark of Bruker Biosystems. FastLoc, MSQ, and Xcalibur are trademarks of Thermo Electron Corporation. All other trademarks and registered trademarks are the property of Dionex Corporation. 2009年7月印于北京