几丁质对海洋生防酵母rhodosporidiumpaludigenum抑菌活性的影响及相关机理的研究大学论文

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1、哈尔滨工业大学学士学位论文工学学士毕业论文几丁质对海洋生防酵母(Rhodosporidium paludigenum)抑菌活性的影响及相关机理的研究 A Thesis for the Degree of B. Eng Impact and Mechanism of Chitin on the Marine Yeasts Antibacterial Activity（Times New Roman二号加粗居中）Candidate：Laifeng LuSupervisor：Guangfeng KanAcademic Degree Applied for：Bachelor of Engineerin

2、gSpecialty：Food Science and EngineeringDate of Oral Examination：June, 2010University：Harbin Institute of Technology摘 要生物防治是采用微生物菌株或抗菌素类物质，通过喷洒或浸渍果实处理，以降低或防治果实采后病害的保鲜方法。本实验通过利用酵母细胞壁组分之一几丁质诱导培养本实验室分离得到的拮抗菌株海洋酵母Rhodosporidium paludigenum Fell & Tallman（经英国国际微生物所菌种保存和鉴定中心CABI Bioscience Identification S

3、ervices鉴定为Rhodosporidium paludigenum Fell & Tallman）以提高其采后果实病害生物防治效果。关键词： Rhodosporidium paludigenum；几丁质；诱导；生物防治ABSTRACTBiological control is a method that using microbial strains or antibiotic substances, by spraying or dipping, to decrease postharvest decay of fruits. We planned to use chitin (one

4、 of the yeast cell wall components) to co-culture with Rhodosporidium paludigenum Fell & Tallman isolated by our laboratory Colleague in marine yeast (Identified by CABI Bioscience Identification Services as Rhodosporidium paludigenum Fell & Tallman) to enhance the effectiveness of its biological co

5、ntrol of postharvest decays of fruits. Key words: R. paludigenum; Chitin; Induction; BCPD毕业设计（论文）原创性声明和使用授权说明原创性声明本人郑重承诺：所呈交的毕业设计（论文），是我个人在指导教师的指导下进行的研究工作及取得的成果。尽我所知，除文中特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或组织已经发表或公布过的研究成果，也不包含我为获得 及其它教育机构的学位或学历而使用过的材料。对本研究提供过帮助和做出过贡献的个人或集体，均已在文中作了明确的说明并表示了谢意。作 者 签 名： 日 期： 指导教师签名： 日

6、期： 使用授权说明本人完全了解 大学关于收集、保存、使用毕业设计（论文）的规定，即：按照学校要求提交毕业设计（论文）的印刷本和电子版本；学校有权保存毕业设计（论文）的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务；学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文；在不以赢利为目的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。作者签名： 日 期： 学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意

7、识到本声明的法律后果由本人承担。作者签名： 日期： 年 月 日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权 大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。涉密论文按学校规定处理。作者签名：日期： 年 月 日导师签名： 日期： 年 月 日指导教师评阅书指导教师评价：一、撰写（设计）过程1、学生在论文（设计）过程中的治学态度、工作精神 优 良 中 及格 不及格2、学生掌握专业知识、技能的扎实程度 优 良 中

8、 及格 不及格3、学生综合运用所学知识和专业技能分析和解决问题的能力 优 良 中 及格 不及格4、研究方法的科学性；技术线路的可行性；设计方案的合理性 优 良 中 及格 不及格5、完成毕业论文（设计）期间的出勤情况 优 良 中 及格 不及格二、论文（设计）质量1、论文（设计）的整体结构是否符合撰写规范？ 优 良 中 及格 不及格2、是否完成指定的论文（设计）任务（包括装订及附件）？ 优 良 中 及格 不及格三、论文（设计）水平1、论文（设计）的理论意义或对解决实际问题的指导意义 优 良 中 及格 不及格2、论文的观念是否有新意？设计是否有创意？ 优 良 中 及格 不及格3、论文（设计说明书）所

9、体现的整体水平 优 良 中 及格 不及格建议成绩： 优 良 中 及格 不及格（在所选等级前的内画“”）指导教师： （签名） 单位： （盖章）年 月 日评阅教师评阅书评阅教师评价：一、论文（设计）质量1、论文（设计）的整体结构是否符合撰写规范？ 优 良 中 及格 不及格2、是否完成指定的论文（设计）任务（包括装订及附件）？ 优 良 中 及格 不及格二、论文（设计）水平1、论文（设计）的理论意义或对解决实际问题的指导意义 优 良 中 及格 不及格2、论文的观念是否有新意？设计是否有创意？ 优 良 中 及格 不及格3、论文（设计说明书）所体现的整体水平 优 良 中 及格 不及格建议成绩： 优 良 中

10、 及格 不及格（在所选等级前的内画“”）评阅教师： （签名） 单位： （盖章）年 月 日哈尔滨工业大学学士学位论文 目录教研室（或答辩小组）及教学系意见教研室（或答辩小组）评价：一、答辩过程1、毕业论文（设计）的基本要点和见解的叙述情况 优 良 中 及格 不及格2、对答辩问题的反应、理解、表达情况 优 良 中 及格 不及格3、学生答辩过程中的精神状态 优 良 中 及格 不及格二、论文（设计）质量1、论文（设计）的整体结构是否符合撰写规范？ 优 良 中 及格 不及格2、是否完成指定的论文（设计）任务（包括装订及附件）？ 优 良 中 及格 不及格三、论文（设计）水平1、论文（设计）的理论意义或对解

11、决实际问题的指导意义 优 良 中 及格 不及格2、论文的观念是否有新意？设计是否有创意？ 优 良 中 及格 不及格3、论文（设计说明书）所体现的整体水平 优 良 中 及格 不及格评定成绩： 优 良 中 及格 不及格（在所选等级前的内画“”）教研室主任（或答辩小组组长）： （签名）年 月 日教学系意见：系主任： （签名）年 月 日目 录摘 要ABSTRACT第一章 文献综述11.1 我国水果产业发展概述11.2 果蔬采后病害的侵染研究1 1.2.1 采后病原真菌的侵染方式1 1.2.2 采后病原真菌的致病机理21.3 果蔬采后病害的控制方法2 1.3.1 化学杀菌剂的使用3 1.3.2果实采后病

12、害防治物理方法3 1.3.3果实采后病害生物防治41.4 采后拮抗酵母作用机制4 1.4.1营养和空间的竞争4 1.4.2重寄生作用5 1.4.3胞外活性物质的产生5 1.4.4诱导抗性6 1.4.5抗生作用61.5 拮抗菌生理调控及机理的研究7 1.5.1逆境培养7 1.5.2拮抗物质的分泌和积累8 1.5.3 基因工程技术的应用81.6 本课题研究目的81.7 应用前景和学术价值9第二章 海洋酵母R. paludigenum对果实采后真菌病害抑制效果研究102.1 前言102.2 实验材料和方法10 2.2.1 主要仪器10 2.2.2拮抗菌及其培养10 2.2.3 病原菌培养和孢子悬浮液

13、的制备10 2.2.4 试剂11 2.2.5 果实选择与预处理11 2.2.6 几丁质对R. paludigenum生防效果的影响11 2.2.7 数据处理分析与作图132.3 结果13 2.3.1 不同浓度几丁质对R. paludigenum生防效力的影响13 2.3.2几丁质诱导后不同浓度R. paludigenum酵母的生防效果15 2.3.3 不同培养时间对几丁质诱导下R. paludigenum生防效力的影响17 2.3.4 几丁质与NaCl结合诱导对R. paludigenum生防效力的影响192.4 讨论20第三章 海洋酵母R. paludigenum对果实采后真菌病害抑制机理研

14、究243.1 前言243.2 实验材料和方法24 3.2.1 主要仪器24 3.2.2拮抗菌及其培养26 3.2.3 病原菌培养和孢子悬浮液的制备26 3.2.4 果实选择与预处理26 3.2.5 几丁质对R. paludigenum生防机理的影响26 3.2.6 数据处理分析与作图273.3 结果28 3.3.1几丁质对R. paludigenum在果实伤口处生长动态的影响28 3.3.2几丁质处理后R. paludigenum对果实诱导抗性的影响29 3.3.3几丁质处理后R. paludigenum发酵上清液的抑菌效果30 3.3.4 几丁质培养后R. paludigenum对果实POD

15、酶活性的影响313.4 讨论32第四章 结果与展望344.1 本论文的主要研究结果344.2 本实验的后续研究及展望34致谢32参考文献33附 录375哈尔滨工业大学工学学士学位论文 第一章 文献综述章节，小二黑体居中，下同第一章 文献综述二级标题，小三黑体，下同1.1 我国水果产业发展概述水果是维生素、矿物质和膳食纤维的重要来源，是人们维持身体健康，增进营养必不可少的主要食品，是世界上仅次于粮食的农产品。.正文内容为小四字体，行距1.25，中文为宋体，英文为Times New Roman，下同1.2 果蔬采后病害的侵染研究三级标题，四号黑体，下同由真菌病害引起的果实采后的腐烂变质是导致水果大

16、量损失的主要原因之一。.1.2.1 采后病原真菌的侵染方式采后病原真菌主要通过3种途径或方式入侵果实：(1)通过机械伤或虫害等造成的伤口；(2)通过自然开放的皮孔、气孔、果实和花梗结合部位；(3)通过分泌寄主细胞壁水解酶等直接突破果实表皮的防御机制（Prusky和Lichter, 2007）。病原菌孢子一旦接触伤口组织，侵染就开始了（Janisiewicz和Korsten, 2002；Prusky和Lichter, 2007）。引用的参考文献多于1篇时，按照论文发表时间的先后次序时行引用1.2.2 采后病原真菌的致病机理四级标题，小四号黑体，下同物种拉丁名第一次出现属名写出全称，随后用其缩写采

17、后病原真菌具有众多而且复杂的致病机理，但其最终目的都是成功的侵染寄主。1.2.2.1致病菌酸化果实组织Pseudomonas expansum、P. digitatm 和P. italicum 等酸性病原真菌能产生柠檬酸和葡萄糖酸等有机酸，使寄主果实组织发生酸化，进而促进病原菌致病因子，如PG基因（pepgl）的表达（Prusky et al., 2004）。1.2.2.2致病因子CAT非共知的英文缩写在文中第一次出现时需要写出全称，并给出中文意思活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）在植物和微生物相互作用过程中具有重要作用（Torres et al., 2006)。

18、最近，中科院植物所Qin等（2007）利用蛋白组学技术发现，。1.2.2.3病原菌破坏植物自身防御机制植物在遭到病原菌侵染时，通过体内木质素和羟脯氨酸糖的沉积，植物抗菌素的积累，蛋白质酶抑制剂和溶菌酶的合成来增强细胞壁的保卫反应。1.3 果蔬采后病害的控制方法果蔬贮藏保鲜是果蔬生产减损、保值和增值的关键因素。1.3.1 化学杀菌剂的使用目前，化学杀菌剂是防治果蔬采后真菌病害的主要手段之一。1.3.2果实采后病害物理防治果蔬采后病害防治物理方法主要有：热处理；低温冷藏；微波处理；气调；辐射处理；低压处理。低温冷藏技术已经在部分地区得到实际运用，热杀菌和辐照杀菌也是目前报道比较多的方法。1.3.3

19、果实采后病害生物防治从可持续发展的角度出发，开发新型、高效且安全的有机、绿色的保鲜剂具有重大的社会意义和广阔的应用前景。1.4 采后拮抗酵母作用机制根据已有的研究结果显示，微生物对病原菌有直接作用和间接作用两种方式，直接作用包括抗生作用和重寄生作用，间接作用包括营养和空间的竞争，胞外活性物质的产生和诱导抗性等。1.4.1营养和空间的竞争为了抑制病原菌的侵染, 拮抗菌必须在病原菌到达以前或到达以后的很短时间内在果实表面侵染部位占据优势。1.4.2重寄生作用许多酵母拮抗菌可以分泌胞外水解酶（几丁酶，-1,3-葡聚糖酶等），从而分解病原菌的细胞壁或菌丝体。1.4.3胞外活性物质的产生五号宋体加粗居中

20、图表在文中一定要有引用，且图表紧随文字描述之后一些研究结果显示，拮抗菌与病原菌互作时, 在果实伤口部位生长的酵母细胞外围有大量的新生物质。这些胞外活性物质可能参与了拮抗菌与病原菌之间的相互作用（表1-1）。抗生素名称产生菌株针对病原菌蒿属香豆素、东莨菪亭无名假丝酵母(C. famata)指状青霉毒性蛋白(killer protein)毕赤酵母属(Pichia sp.)抗细菌物质罗伦隐球酵母（C. laurentii）荧光假单胞菌、Staphylococcus aureus挥发性物质乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)扩展青霉表1-1 主要产胞外物质菌株三线表1.4.4诱导

21、抗性近5年来，拮抗菌诱导采后果实抗性成为了生物防治的研究热点。1.4.5抗生作用通过拮抗菌产生抗生素抑制病原菌作用是人们最早发现的一种拮抗机理，也是大多数拮抗细菌最主要的机制之一（表1.3）（Janisiewicz and Roitman, 1988; Janisiewicz et al., 1991）。表1-2 采后拮抗菌对果实抗性的诱导及对抗性相关反应的刺激果实拮抗菌备注苹果出芽短梗霉C. saitoana刺激果实几丁质酶、葡聚糖酶和POD诱导抗性，并刺激果实几丁质酶、b-1,3-葡聚糖酶分泌b-1,3-葡聚糖酶柚子柑橘C. oleophila诱导抗性，并刺激果实乙烯、PAL, 几丁质酶、

22、b-1,3-葡聚糖酶、积累植保素等刺激果实硫还原蛋白基因表达刺激几丁质酶cDNA的表达刺激b-1,3-内葡聚糖酶基因表达草莓出芽短梗霉诱导抗性樱桃番茄膜醭毕赤酵母刺激果实POD，降低CAT和SOD，提高总蛋白，增强33和47kDa 蛋白刺激果实几丁质酶、b-1,3-葡聚糖酶桃、梨、枣、苹果罗伦隐球酵母诱导果实抗性；刺激果实几丁质酶、b-1,3-葡聚糖酶、POD和PAL活性刺激果实b-1，3-葡聚糖酶基因表达表1-3 主要产抗生素菌株抗生素名称产生菌株作用对象病原菌伊枯草菌素枯草芽孢杆菌B-3核果类水果M. fructicola吡咯菌素洋葱假单胞菌(P. cepacia) LT-4-12W梨果、

23、柑橘核果类水果扩展青霉、灰葡萄孢丁香霉素E丁香假单胞杆菌ESC-10和ESC-11（BioSave）柠檬吡喃酮木霉草莓、苹果灰葡萄孢1.5拮抗菌生理调控及机理的研究近年来，随着拮抗菌和病原菌之间的细胞学、生物化学和分子生物学研究的不断深入发展，研究者发现通过调节采后拮抗酵母的生理代谢机制可能是增强其拮抗能力的有效途径之一（Janisiewicz和Korsten, 2002）。1.5.1逆境培养Teixid等（1998）研究表明通过低水分活度培养Candida sake后其在采前使用时生长数量明显增加并增强了酵母的拮抗效力，其机理与积累糖醇和海藻糖有关；。1.5.2拮抗物质的分泌和积累阿根廷学者

24、发现粘红酵母（Rhodotorula glutini)产生的一种酸（rhodotorulic acid）能抑制许多病原真菌，而且发现整合使用rhodotorulic acid和该粘红酵母能增强其对果实病害的控制（Calvente et al., 2001；Sansone et al., 2005）。1.5.3基因工程技术的应用利用分子生物学和基因工程的手段研究拮抗菌的遗传背景并开展相应分子水平的改造是生物防治领域的一个研究热点，。1.6 本课题研究目的近年来，采后生物保鲜剂的发展遇到了瓶颈。本试验目的是解决瓶颈问题之一，探讨通过在培养基中添加几丁质等培养酵母R. paludigenum提高其拮

25、抗效力的可行性，以提高酵母的生防效果。研究几丁质诱导后R. paludigenum对苹果、梨采后主要真菌病害扩展青霉（P. expansum）体内的抑制效果，筛选出最佳诱导剂量及诱导时间，并结合其他诱导因子为苹果、梨采后病害提供一种安全、经济有效的防治方法，并对可能存在的相关机理，包括促进酵母菌生长、分泌抗菌物质和诱导抗性等进行系统研究。1.7应用前景和学术价值利用拮抗酵母对水果采后病害进行生物防治是目前国内外研究的热点，其对于保护生态环境、减少食品农药残留、保障公众健康具有重要意义。但是要实现拮抗酵母的商业化推广应用，迫切需要解决的问题是提高其生物学效力。章节间要有分页符32哈尔滨工业大学学

26、士学位论文 第二章 海洋酵母R. paludigenum对果实采后真菌病害抑制效果研究第二章 海洋酵母R. paludigenum对果实采后真菌病害抑制效果研究2.1 前言生物防治是采用微生物菌株或抗菌素类物质，通过喷洒或浸渍果实处理，以降低或防治果实采后病害的保鲜方法。2.2材料和方法2.2.1 主要仪器TH-3560全自动灭菌锅 造鑫(TSAO HSIN)企业有限公司 SW-CJ-1F超净工作台 苏州安泰空气技术有限公司SIGMA 3K-15离心机 德国希格玛（SIGMA）公司QYC-211全温空气摇床 上海福玛实验设备有限公司Sartrious电子天平 北京赛多利斯天平有限公司200 m

27、l、1000 ml、5ml移液器 德国Eppendorf 公司 血球计数板（2516） 上海医用光学仪器厂光学显微镜 日本奥林巴斯有限公司LRH-250生化培养箱 上海一恒科技有限公司2.2.2拮抗菌及其培养2.2.2.1 拮抗菌Rhodosporidium paludigenum，分离自中国东海近海海域，并经英国国际微生物所菌种保存和鉴定中心（CABI Bioscience Identification Services）鉴定。2.2.2.2酵母诱导培养保存的酵母菌种首先在NYDA斜面培养基中进行活化，。2.2.3 病原菌培养和孢子悬浮液的制备2.2.3.1 病原菌病原菌为扩展青霉（Peni

28、cillium expansum），。2.2.3.2 病原菌菌悬液的制备从病原菌保存斜面中挑取适量的霉菌孢子，。2.2.4 试剂几丁质（Chitin）为生化纯试剂，使用前先研磨，并用100目筛网过滤后备用。2.2.5 果实选择与预处理试验所用果实为正常商业成熟度的苹果 (Malus domestica)果实，。2.2.6 几丁质对R. paludigenum生防效果的影响2.2.6.1 不同浓度几丁质对拮抗酵母生防活性的影响酵母活化和液体培养、菌体收集同2.2.2.2，。2.2.6.2 几丁质诱导后不同浓度R. paludigenum酵母的生防效果用消过毒的打孔器在每个果实表面形成统一大小和深

29、度的伤口。2.2.6.3 不同培养时间对几丁质诱导拮抗酵母生防活性的影响酵母活化和液体培养、菌体收集同2.2.2.2，。2.2.6.4 几丁质与NaCl结合诱导对拮抗酵母生防活性的影响酵母活化和液体培养、菌体收集同2.2.2.2，。2.2.7 数据处理分析与作图采用SPSS软件(Statistical Product and Service Solutions)进行数据统计，数据采用ANOVA进行邓肯氏差异分析方法（取p0.05）。采用OriginPro7.5软件作图。2.3 结果2.3.1 不同浓度几丁质对R. paludigenum生防效力的影响在不同浓度的NYCB中诱导培养后，R. pa

30、ludigenum对梨青霉病的生防效力显著提高（图2-1和图2-2）。图题五号字，加粗，居中排列，中文英对照一致，图注字体为小五号能用图表示的结果最好用图，不要用表格，数据尽量作统计学分析能用图表示的结果最好用图，不要用表格，数据尽量作统计学分析图2-1 不同浓度几丁质培养后的R. paludigenum对梨青霉病的抑制效果温表注：线条代表3个重复的标准误，不同的字母表示Duncan多重测试得出的差异显著性Fig. 2-1 Incidence of blue mold decay caused by Penicillium expansum on pears inoculated with R

31、. paludigenum cultured with different concentrations of chitin. Notes: Bars represent standard errors of three replications. Different letter indicates significant differences (P 0.05) according to the Duncans multiple range tests.图2-2 不同浓度几丁质培养后R. paludigenum对梨青霉病病斑直径的影响Fig. 2-2 Severity of blue mo

32、ld decay caused by Penicillium expansum on pears inoculated with R. paludigenum cultured with different concentrations of chitin. Bars represent standard errors of three replications. Different letter indicates significant differences (P 0.05) according to the Duncans multiple range tests.类似的，在苹果果实上

33、，。 图2-3 不同浓度几丁质培养后第5天R. paludigenum对苹果青霉病的生防效果注：A: NYDB 培养的R. paludigenum; B: 0.1%（w/v）几丁质NYDB 培养的R. paludigenum; C: 0.2%（w/v）几丁质NYDB 培养的R. paludigenum; D: 1.0%（w/v）几丁质NYDB 培养的R. paludigenum; E: 2.0%（w/v）几丁质NYDB 培养的R. paludigenum.Fig. 2-3 Incidence of blue mold decay caused by Penicillium expansum o

34、n apples inoculated with R. paludigenum cultured with different concentrations of chitin. Notes: A: R. paludigenum cultured in NYDB; B: R. paludigenum cultured in NYDB with 0.1% chitin; C: R. paludigenum cultured in NYCB with 0.2% chitin; D: R. paludigenum cultured in NYCB with 1.0% chitin; E: R. pa

35、ludigenum cultured in NYCB with 2.0% chitin. Bars represent standard errors of three replications.2.3.2几丁质诱导后不同浓度R. paludigenum酵母的生防效果实验结果表明，。2.3.3 不同培养时间对几丁质诱导R. paludigenum生防效力的影响1.0%（w/v）的NYCB培养基分别培养24、36、48、72和96 h后，。2.3.4 几丁质与NaCl结合诱导对R. paludigenum生防效力的影响几丁质与NaCl结合诱导后，R. paludigenum对梨青霉病的抑制效果2

36、.4 讨论试验结果表明：。哈尔滨工业大学学士学位论文 第三章 海洋酵母R. paludigenum对果实采后真菌病害抑制机理研究第三章 海洋酵母R. paludigenum对果实采后真菌病害抑制机理研究3.1 前言利。 3.2材料和方法3.2.1 主要仪器TH-3560全自动灭菌锅 造鑫(TSAO HSIN)企业有限公司 SW-CJ-1F超净工作台 苏州安泰空气技术有限公司SIGMA 3K-15离心机 德国希格玛（SIGMA）公司QYC-211全温空气摇床 上海福玛实验设备有限公司Sartrious电子天平 北京赛多利斯天平有限公司200 ml、1000 ml、5ml移液器 德国Eppendo

37、rf公司 血球计数板（2516） 上海医用光学仪器厂光学显微镜 日本奥林巴斯有限公司LRH-250生化培养箱 上海一恒科技有限公司酶标仪 美国分子仪器公司（MDA）3.2.2拮抗菌及其培养见2.2.2。3.2.3 病原菌培养和孢子悬浮液的制备见2.2.3。3.2.4 果实选择与预处理见2.2.5。3.2.5 几丁质对R. paludigenum生防机理的影响3.2.5.1 几丁质对R. paludigenum在果实伤口处生长动态的影响用。3.2.5.2几丁质处理后R. paludigenum对果实诱导抗性的影响参照de Capdeville等（2002）、Droby等（2002）和El Gha

38、outh等（2003）的方法进行苹果果实伤口系统抗性的诱导试验。果。3.2.5.3几丁质处理后R. paludigenum发酵上清液的抑菌效果用。3.2.5.4几丁质培养后R. paludigenum对果实POD酶活性的影响每个处理选取6个果实，置于塑料筐中，共3个重复。3.2.5.4.1酶的提取和测定称取3 g果实组织加入5 mL冷(4)的50 mmol l-1含1.33 mmol l-1 EDTA和1% PVPP PBS缓冲液(PH 7.8)。3.2.5.4.2过氧化物酶（peroxidase, POD）活性测定POD活性采用愈创木酚方法测定（Lurie et al., 1997），。3.

39、2.6 数据处理分析与作图采用SPSS软件(Statistical Product and Service Solutions)进行数据统计，数据采用ANOVA进行邓肯氏差异分析方法（取p0.05）。采用OriginPro7.5软件作图。3.3 结果3.3.1几丁质对R. paludigenum在果实伤口处生长动态的影响当接种菌悬液浓度为1106 cells/mL时，在024 h内，两处理组的生长速率及菌体总量均无显著性差异，但24 h后，几丁质处理组在生长速率及菌体总量方面显著提高（图3-1）。图3-1 几丁质诱导后1106 cells/mL R. paludigenum在苹果果实伤口处的生

40、长动态Fig. 3-1 Population dynamics of R. paludigenum in wounds of apples incubated at 25. Wounds were treated with 50ml of 1106cells/mL washed cell suspension of R. paludigenum alone. Bars represent standard errors of three replications. * Symbols indicates significant differences (P 0.05) according to

41、 the Duncans multiple range test.图3-2 几丁质诱导后1107 cells/mL R. paludigenum在苹果果实伤口处的生长动态Fig. 3-2 Population dynamics of R. paludigenum in wounds of apples incubated at 25. Wounds were treated with 50ml of 1107 cells/mL washed cell suspension of R. paludigenum alone. Bars represent standard errors of th

42、ree replications. * Symbols indicates significant differences (P 0.05) according to the Duncans multiple range test.3.3.2几丁质处理后R. paludigenum对果实诱导抗性的影响试验表明（图3-3和3-4），经NYDB和NYCB培养的R. paludigenum 均可以诱导苹果果实对病原菌的抗性，而且经过NYCB培养的酵母，其对果实抗性的诱导作用增强。图3-3几丁质培养后R. paludigenum对苹果诱导抗性的增强效应（发病率）Fig. 3-3 Incidence o

43、f blue mold decay caused by Penicillium expansum on apples inoculated with R. paludigenum cultivation in NYDB or NYDB amended with chitin powder at 1.0 % on induction of resistance to blue mold rots in apple fruit. Bars represent standard errors. Different letter indicates significant differences (P

44、 0.05) according to the Duncans multiple range test.图3-4几丁质诱导后R. paludigenum对苹果抗性的增强效应（病斑直径）Fig. 3-4 Severity of blue mold decay caused by Penicillium expansum on apples inoculated with R. paludigenum cultivation in NYDB or NYDB amended with chitin powder at 1.0 % on induction of resistance to blue

45、mold rots in apple fruit. Bars represent standard errors. Different letter indicates significant differences (P 0.05) according to the Duncans multiple range test.3.3.3几丁质处理后R. paludigenum发酵上清液的抑菌效果 如图3-5所示，R. paludigenum 在NYDB中培养后的上清液没有抑菌效力，反而有促进效果。图 3-5 几丁质培养R. paludigenum 后的发酵上清液对苹果青霉病的抑制Fig. 3-5

46、 Effect of culture filtrate of R. paludigenum after cultivation in NYDB or NYDB amended with chitin powder at 1.0% on reduction of lesion diameter of Penicillium expansum in apple fruit wounds. Bars represent standard errors. Different letter indicates significant differences (P 0.05) according to t

47、he Duncans multiple range tests.3.3.4 几丁质培养后R. paludigenum对果实POD酶活性的影响试验结果（见图3-6）显示，。图3-6 几丁质培养后的酵母R. paludigenum对苹果POD活性的影响Fig. 3-6 Effects of R. paludigenum cultivation in NYDB or NYDB amended with chitin powder at 1.0 % on the peroxidase activity in apple fruit. Bars represent standard errors of

48、three replications.3.4 讨论为进一步明确几丁质提高酵母拮抗效力的机理，本试验对几丁质培养后R. paludigenum的生长动态、发酵上清液的抑菌性,果实抗性的诱导和果实POD酶的激活活等进行了研究。哈尔滨工业大学学士学位论文 第四章 本论文的主要结果及展望第四章 结果与展望4.1 本论文的主要研究结果（1）试验结果表明，经几丁质诱导后，R. paludigenum的果实采后青霉病害生物防治效果得到显著提高。其机理可能与几丁质诱导培养后能促进R. paludigenum 在果实伤口处的生长、分泌抑菌物质和诱导果实抗性的能力有关。（2）几丁质对R. paludigenum生

49、防效力的最佳诱导浓度为1.0%（w/v），最佳诱导培养时间为3648 h。此外，试验结果表明，几丁质诱导培养与NaCl诱导培养之间并不存在协同增效作用。（3）R. paludigenum 在NYDB中培养后的上清液没有抑菌效力，反而有促进效果。而在添加几丁质的培养基培养后，R. paludigenum的发酵上清液显示了出对扩展青霉在苹果果实伤口处侵染一定的抑制作用。这一结果暗示几丁质可能刺激R. paludigenum分泌了抑菌相关物质，其确切机理尚待进一步研究。（4）果实诱导抗性试验结果表明，R. paludigenum能激发苹果果实对青霉病的抗性，而经NYCB培养基培养的酵母能进一步显著增

50、强这种对果实抗性的诱导作用。其机理可能与激发苹果果实伤口处组织的POD酶活性有关。4.2 本实验的后续研究及展望本论文仅对几丁质诱导后，R. paludigenum 酵母的生防活性、最佳诱导条件诱导机理，包括促进酵母菌生长、分泌抗菌物质和诱导抗性等进行了初步研究。酵母及果实内部具体分子作用机理，例如,基因组功能及表达、信号通路作用关系、蛋白激活等作用机制并不清楚。所以具体作用机制有待后续实验进行揭示分析，以增强生物防治的效果。鉴于生防酵母的拮抗效力可能不是由一个或几个蛋白、基因或其它因子所决定，而更可能是由多种、甚至数十种或更多的蛋白综合作用的结果（Massart和Jijakli，2006），

51、因此利用基因组学和蛋白组学技术对拮抗酵母全基因组或蛋白组的动态变化开展全面的分析和比较研究是十分有必要的，以期进一步揭示酵母的拮抗机理，并全面筛选和鉴定与酵母拮抗机理密切相关的基因和蛋白质。Massart和Jijakli（2006）利用比较基因组学技术（cDNA-AFLP）获得了用病原菌细胞壁提取物培养采后拮抗酵母（P. anomala）后的一些差异基因，包括细胞壁代谢相关的基因，本实验准备采用蛋白组学和基因组学相关技术，系统全面地筛选并鉴定与拮抗酵母生防效力相关的蛋白和基因，通过研究拮抗酵母内在的生理和分子机制及其与生防效力的关系，更好地阐明拮抗酵母的作用机制，为明确其作用模式提供新的认识，

52、为探索提高其生防效力的途径提供新的思路，并为今后利用生物工程技术手段对拮抗酵母进行定向改造进一步提高其生防效力提供理论基础。哈尔滨工业大学学士学位论文 致 谢小四宋体小二黑体居中致 谢岁月匆匆，时光荏苒，转瞬间四年的大学生活即将结束。在临近毕业之际，我在此对四年中教导过、激励过、帮助过我的人再次说一声感谢：是你们传授给我知识与教授于我文化；是你们在我困难时，为我排忧解难，在我快乐时，与我一同分享；是你们教会了我怎样在人生的道路上继续奔跑。首先，我要感谢在本科学习、实验和生活期间给予我精心指导、悉心指教和温暖关怀的阚光锋副教授。他渊博的专业知识，严谨的治学态度，精益求精的工作作风，诲人不倦的高尚

53、师德，严以律己、宽以待人的崇高风范，朴实无华、平易近人的人格魅力对我影响深远；其次，感谢在平时的工作和学习中给予我耐心指导和许多帮助的曹竞老师，作为位良师益友，他们为我现在和以后的道路打下了坚实的基础。感谢浙江大学郑晓冬教授在我毕业实习期间，在学业、实验和生活上给予的悉心指导和无私帮助；感谢余挺副教授从论文选题到文章定稿过程中给与的悉心细致的教诲和无私的帮助，整个实验的每一步都是在他的指导下完成的，倾注了余挺老师大量的时间和精力；同时感谢卢黄娉师姐在我实验实际操作及论文编写过程中给与的极大帮助。感谢06级食品科学与工程专业的所有授课老师，是你们传授我了知识，教会了我去学习。在你们的课程或实验上

54、我获得了很多；感谢王凯老师、赵婷老师在保研时给予的指导和帮助。在此，谨向以上各位老师表示崇高的敬意和衷心的感谢！感谢陪我走过四年大学生活的0607501班全体同学，谢谢你们曾经予我的信任和鼓励，帮助和关怀，不管未来有多遥远，成长的路上有你有我。不管相逢在什么时候，我们是永远的朋友；感谢在实习期间，浙江大学食品506实验室的王一非、殷赟、刘燕、任雪艳师姐，李汉林、陆蕾、王鹏、倪庚、唐飞师兄在实验和生活上给予的指导和帮助；感谢617寝室的兄弟们，感谢你们共享着我的快乐，分担着我的悲伤；感谢我亲爱的父母多年来对我的养育之恩和谆谆教诲，你们辛苦了。最后，再次感谢所有关心，帮助和支持我的老师、朋友和家人

55、！谢谢大家！谢谢大家一路上陪我、帮助我！ 2010.06.15 路来风哈尔滨工业大学学士学位论文 参考文献五号字体，按字母排序，格式统一小二黑体居中参考文献Ahmed AS, Ezziyyani M. Snchez CP, Candela ME. 2003. Effect of chitin on biological control activity of Bacillus spp. and Trichoderma harzianum against root rot disease in pepper (Capsicum annuum) plants. European Journal o

56、f Plant Pathology 109: 633637.Akimitsu K, Isshiki A, Ohtani K, Yamamoto H, Eshel D, Prusky D. 2004. Sugars and pH: A clue to the regulation of fungal cell wall-degrading enzymes in plants. Physiological and Molecular Plant Pathology 65: 271275.Andrews, J. H., Harris, R. F., Spear, R. N., Lau, G. W., Nordheim, E. V., 1994. Morphogenesis and adhesion of Aureobasidium pullulans. Canadian Journal of Microbiology 40: 6-17.Ando A, Nakamura T, Murata Y, Takagi H, Shima J. 2007. Identification and classification of genes required for tolerance to freeze-