组织裂解液和细胞裂解液的配制

《组织裂解液和细胞裂解液的配制》由会员分享，可在线阅读，更多相关《组织裂解液和细胞裂解液的配制（8页珍藏版）》请在装配图网上搜索。

1、组织裂解液和细胞裂解液如何配制?一、细胞裂解液配制措施一一、试剂准备1、新鲜配制冷的 RIPA 裂解缓冲液:1 m NaCL1%NP40 （去垢剂)0.% SDS (去垢剂)2ug/mlApotini(蛋白酶克制剂) (使用前加入)2mleupeptin (蛋白酶克制剂) (使用前加入)1mM PMF (蛋白酶克制剂).5 mM EDT(蛋白酶克制剂)1mM aVaadat (磷酸脂酶克制剂)(任选)以上所有试剂均按比例溶于0 mM NaCL溶液中。2、冷的PBS中加入 1 mM MF1.5 mMDTA1m NaVanadte(钒酸钠）(任选）3、对数期生长状态佳的细胞，7m至少3-4瓶（90

2、%以上生长面积)。二、实验环节1、将长满细胞的培养瓶放置在冰上, 用吸液管吸出培养液。加入足够的冷的B在培养瓶中充足洗涤细胞表面，以洗去瓶中残留的培养基,倒掉B ，反复以上操作2-3遍。在最后一次洗涤中尽量吸干残留的PBS,尽量在冰上操作。2、 向培养瓶中加入冷的RIPA 裂解缓冲液 (每7m2 培养瓶加1m）.然后用细胞刮子沿着瓶壁开始刮细胞,如果所需要刮的同种细胞有多瓶,则将第一瓶刮下的细胞液吸出转入下一瓶中继续刮 （由于解决后的细胞裂解液较粘稠,因此宜用直径大点的吸液管吸取)。、吸出刮好的细胞裂解液置于14ml 离心管中 （置于冰上），然后反复环节2以刮取剩余的细胞。4、尽量将多的细胞裂

3、解液收集到14m的离心管中，样品插入冰盒进行超声，超声强度以不产生泡沫为准，超声每次2-3秒，反复-次。如仍有细胞碎片或沉淀,应离心100rp，1分钟,留取上清。、 取出小量细胞裂解液测其蛋白浓度（用Biad Bdfor试剂盒或紫外分光光度计,在280测定)，分装保存在 -7。4措施二N40 r ri-10 %TrisHl (pH 0) 5moLNal 10mol/LMS（苯甲基磺酰氟).1mol(100g/ml)Pepstatin（胃蛋白酶克制剂) 1 o/L(07g/)Leuept(亮克制肽) 0.5m/lprotin（抑蛋白酶肽)0mol/L(1gm)(注：SF贮存液：100mmolL即

4、17.4mg/m于异丙醇中；Aprotinin 贮存液：10mg/ml溶于0.01mol/EPS（pH);Leupn 贮存液:10mg/l溶于水中；Peptatin 贮存液 10mgml于甲醇液中均于0保存）裂解操作程序:离心收集107个细胞 加入4预冷%N0裂解液00*剧烈震荡使细胞充足悬浮混匀（如为组织进行匀浆）* 4放置1530min 离心,1 00rpm,10mi,取上清备用。措施三 细胞裂解液的重要目的:1.运用去污剂破坏脂质双分子层,破裂细胞；2.溶解蛋白;3.蛋白变性使其稳定；. 克制蛋白酶活性推荐RIPA bufer:. 50 mMTrisl .4缓冲体系 10 M Nal 等

5、渗体系 1 M PM 强大的蛋白酶克制剂 mM 变性剂和稳定剂 5 g/l Artinin(抑肽酶)蛋白酶克制剂 5/epeptin 蛋白酶克制剂 Trio -1 破坏细胞1 oim deoxychlate 中度变性剂和蛋白溶解剂 细胞裂解液的重要目的：1运用去污剂破坏脂质双分子层,破裂细胞;2.溶解蛋白；3. 蛋白变性使其稳定;4 克制蛋白酶活性推荐PAbufer:. 50 ri-HCl 7.4缓冲体系 50 mM Na 等渗体系 mM PMF 强大的蛋白酶克制剂 1 mM DTA变性剂和稳定剂 5 gmlAprotin蛋白酶克制剂5g/mlLupepi 蛋白酶克制剂1% in x10 破坏

6、细胞1% Sodm doxychlate 中度变性剂和蛋白溶解剂01% SDS强变性剂和蛋白溶解剂其中PMSF等蛋白酶克制剂最佳此外配制，0保存,用前混合。蛋白酶克制剂较贵，如果你的经费有限，可以仅用PMSF试一试,能出成果就可以。 用于一般的Wetern、P或-IP,我们推荐使用We及I细胞裂解液（P013)，该裂解液已被国内各大研究机构广泛使用，顾客普遍反映较好。裂解细胞或组织后，没有非常粘滞的透明状D团块形成，不必采用超声解决等就可以非常抱负地用于后续操作。此外该裂解液裂解的产物也合用于磷酸化蛋白的Wesn检测。对于某些特殊蛋白的I，如果发现etern及IP细胞裂解液（P0013）效果不

7、是非常抱负，可以尝试用RPA裂解液(强、中或弱)或N- 裂解液。如果发现IP的时候背景很高,即非特异的蛋白也被IP下来，则需要选用裂解强度较高的裂解液，例如R裂解液（强或中)。如果发现目的蛋白无法被IP下来，则阐明裂解液的强度过强，可以使用较为温和的裂解液例如RIP裂解液(弱)或NP40裂解液。对于某些难溶解蛋白的Wesen，如果发现Wten及IP细胞裂解液效果不是非常抱负,可以尝试使用裂解强度更高的裂解液,例如RIPA裂解液(强、中)或SDS裂解液。RIA裂解体系: 150 mmoL/L Nacl, 1.0%NP40或Trito-x-00，.5%脱氧胆酸钠, 0.1SS,5 mmL/LTri

8、s ( p0)。一、组织裂解液配制组织裂解液配方： 7M Uea（0. 0)42022M thioue(7.12） 522100mM TT0.143 g4% CHAPS0.40.5mMDTA 000146g40Mm Tri 004852（v/v) NP4.2 ml%(v/v) iton -100 0.1 ml5mM MSF用前加.00871g2%phrmalye 0.ml共10l分装成00l/每管（可应用于-80毫克组织裂解)注:已配好分装成400l每管可供应用不需另配！细胞裂解液配方：Uea(0. 06) 1.801g2Mthiurea(.1) 0.7613 g6M DT 000 g4%CH

9、PS 0. g40Mmbase 02425 共5ml分装成20/每管（可应用于50-10ml培养瓶内的细胞裂解）细胞裂解液： 组织裂解液配方: mol/L 尿素、7 Urea（6006) 4042g2 mo硫脲、2Mhioue(76.12） 1.5222P40、2%(/v)NP40 02l1%iton X100、 1%(v/v） riton -100 0.ml6 mmol/L T、010g 10mMDT0.1543 g5 mol/ MSF、 mM F用前加 0087g4% CHAPS、 4% CHAS.4 g0mmol/LTris、 40MTrs 485g2% phamaly（pH3-1)、2

10、pharmalyte 0.l .5DTA 0. g2 g/ DNase I、mg/L Nase 、20mg/Lprotini、20 mg/L lepept、2 mmoL Na3V4、Psphatasehitor Coktilhosphatas Ihbitor Cokail 21m水化液配方:M r（60.06) .4808 g2%CHAPS 0.2g痕量溴酚兰 0.4l1%的痕量溴酚兰（10mg+00双蒸水）45l水化液 加DTT 0.013g 40l水化液 加TT 0.00126mg多种细胞裂解液的功用都分别是什么,D ,NP40 ,Triton-10有何作用SS，P-40 ，Triton-0这三种去垢剂的作用是不同的，或者说作用力量强弱不同。SS属于离子型去垢剂，最厉害，基本可以把细胞完全破掉,DNA会释放出来，裂解液变得很粘稠。NP-40是很温和的去垢剂,1浓度的基本可以破坏掉胞膜，而对核膜破坏的作用弱,结合特定的bufer可以获得胞浆蛋白。TrionX-00的能力介于NP0和SD之间,偏向于P,也是常用的细胞裂解液成分之一，在保护蛋白活性方面有一定作用（SDS基本会使蛋白变性失活)。但是去垢剂属性只是一方面，bufer、配比、浓度、提取措施和材料解决也都是核心因素,建议参照分子克隆来做。