《伊马替尼耐药CML患者ABL基因激酶区突变检测》由会员分享，可在线阅读，更多相关《伊马替尼耐药CML患者ABL基因激酶区突变检测（6页珍藏版）》请在装配图网上搜索。
1、伊马替尼耐药CML患者ABL基因激酶区突变检测宋其芳;瞿燕春;杨红宇;王宏【摘要】目的研究伊马替尼(imatinib,IM)治疗慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)耐药患者ABL酪氨酸激酶区突变情况.方法用巢式PCR 扩增对IM治疗耐药的56例CML患者骨髓样本ABL基因激酶区序列，通过测序和 序列同源性检索分析ABL激酶区突变情况.结果56例患者检出突变17例，其中14 例为点突变,包括 T3151、N358D、F359V、T389A、P441L、E450OK、S410G、 F486S;3例检测出插入突变c.1423-1424ins 35bp(P.CA
2、75YfsX11).慢性期患者突 变12例(28.6%),加速期、急性期突变者分别为4例和1例.IM急变期、加速期患 者突变率高于慢性期，但差异无显著性(x=0.253,P0.05).结果ABL基因激酶 区点突变是CML患者对IM耐药的重要原因，通过检测ABL基因激酶区突变有助 于预测IM疗效并及时调整治疗方案.【期刊名称】临床检验杂志 【年(卷)，期】2011(029)003 【总页数】3页(P185-187) 【关键词】伊马替尼;慢性粒细胞白血病;突变;激酶区 【作者】宋其芳;瞿燕春;杨红宇;王宏【作者单位】暨南大学生命科学技术学院抗体工程研究中心广州,510632;广东省 中医院肿瘤科广
3、州,510120;暨南大学生命科学技术学院抗体工程研究中心广 州,510632;暨南大学生命科学技术学院抗体工程研究中心广州,510632【正文语种】中文 【中图分类】R733.72慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia, CML)主要特征是持续表达BCR- ABL融合基因。此融合基因的产物可激活一系列下游信号通路而导致CML的发生， 已成为CML治疗的重要靶标。伊马替尼(imatinib,IM)可竞争性结合ABL酪氨酸 激酶催化部位的ATP结合位点，导致该激酶失去活性，诱导肿瘤细胞凋亡，用于治 疗CML已取得比较满意的效果。然而，应用IM治疗的部分CML患者用药不
4、久 即发生耐药，主要原因是BCR-ABL激酶区发生点突变。由于不同位点突变导致对 IM耐药程度不同，因此对激酶区进行突变检测变得越来越重要1。本研究收集了 56例发生IM耐药的CML患者骨髓或外周血，用巢式PCR扩增ABL基因激酶区 的基因片段，探讨此区域突变与IM耐药的关系。1对象和方法1.1研究对象 收集2008年2010年在广东省中医院就诊的56例CML患者 49份骨髓及23份外周血标本，患者均经IM治疗，多数标本是在耐药发生时采集。 其中慢性期(chronic phase,CP)患者 42 例，加速(accelerated phase,AP)/ 急变期 (blast phase , B
5、P)14 例；患者年龄分布 110 岁 5 例，10 20 岁 2 例，21 40岁35例，40岁以上14例。CP、AP、BP患者IM疗效、耐药的诊断均符合 血液学诊断及疗效标准2-3。1.2 RNA提取 取12 mL骨髓或23 mL外周血,EDTA抗凝;2 000 r/min 离心 10 min，取 200 pL 中间层细胞，按 Invitrogen PureLinkTM RNA Mini Kit 说明书操作提取RNA，紫外分光光度仪测定260 nm、280 nm处吸光度(A)值， 计算RNA量。1.3逆转录合成 按照TaKaRa PrimeScriptTM RT-PCR Kit说明书操作进
6、行逆 转录。1.4激酶区扩增 巢式PCR扩增BCR-ABL融合基因，引物序列为Primer A : 5,-TTCAGAAGCTTCTCCCTGACAT-3,和 Primer B :5- TGAGGCATCTCAGGCACGTC-3。反应条件：95 C 5 min;94 C 30 s,62 C 30 s,72 C 150 s,共35个循环；72 C 7 min,4 C保存。用内引物扩增ABL 激酶区，引物序列为 Primer C :5-CCAAAGCGCAACAAGCCCAC-3和 Primer D : 5-ACAGCCCCACGGACGCCTTG-3。反应条件：95 C 5 min;94 C
7、30 s,62 C 30 s,72 C 90 s,共32个循环；72 C 5 min,4 C保存。50 pL反应体系中含 100 ng 模板 DNA ,5 pL 10xbuffer, dNTP 各 0.2 mmol/L , MgCl2 2 mmol/L , 引物各 0.5 mol/L , ExTaq DNA 聚合酶 1 U（Tiangen 公司）。1.5测序及序列比对 产物由Invitrogen公司纯化并用3730测序仪（美国应用 生物技术公司）测序，测序结果与参考序列（NCBI序列号：NC_000009.11）进行序 列同源性比较，分析突变情况，判断相应氨基酸。2结果2.1 ABL基因激酶区
8、点突变的检出结果 在IM耐药患者中共发现14个点突变， 分别为 T315I（4 例）、N358D、F359V（2 例）、T389A、P441L、E450K、S410G、 F486S（3例）。S410G为未报道突变。2.2 ABL基因激酶插入突变的检出情况 3例IM耐药患者检测到插入突变 c.1423-1424ins 35 bp（p.C475YfsX11）,序列见图 1。注：a、b,箭头为356 bp插入起始点；c，箭头之间为356 bp插入序列。图1 3例IM耐药患者中ABL基因激酶区突变2.3 S410G突变在蛋白质三维结构的位置以及对蛋白质功能的影响 用 SIFT（sorting into
9、lerant from toletant）4预测 S410G 点突变对蛋白质的影响， 结果S410G点突变对蛋白质功能产生影响，P=0.02 ;通过三维结构预测，得到 正常及突变蛋白质结构，突变位于activation loop区域的a-螺旋上，此区域的 功能是控制酪氨酸激酶的活性，故突变可能影响酪氨酸激酶活性。见图2。注：a，正常蛋白质结构，绿色区域是Ser410位置；b，突变后蛋白质结构，绿色 区域是Gly410位置。图2突变前后蛋白质三维结构图2.4 ABL激酶突变在CP、AP、BP患者中的分布12例CP患者(28.6%)、4例 AP患者(36.4%)、1例BP患者检出突变，后2组患者突
10、变率(35.7%，5/14)高于 CP 患者(28.6% , 12/42),但无显著性差异(x2=0.253, P0.05)。3讨论IM是目前治疗CML的分子靶向药物，但其在临床应用不久就发现耐药现象。耐 药的发生机制包括5 : (1)BCR-ABL融合蛋白的ABL基因激酶区发生突变，IM结 合位点酪氨酸激酶结构域空间构象发生改变，导致IM不能竞争性结合融合蛋白；(2) BCR-ABL融合蛋白过度表达，超过了 IM的竞争结合能力；(3)BCR-ABL融合 基因基因组拷贝数的扩增，也会导致BCR-ABL融合蛋白的过度表达核型改变，例如 del(7q)等；(4)CML克隆的增生不完全依赖BCR-A
11、BL基因，还存在其他基因异常， 如多药耐药基因的异常等。可能上述一种或多种机制一起作用导致耐药，但约50% 的耐药是由于BCR-ABL融合蛋白的ABL激酶区突变引起的。因此，及时发现耐 药突变情况，改用其他的治疗方案十分必要。本研究采用巢式PCR对发生IM耐 药的56例CML患者BCR-ABL融合基因上ABL激酶区进行扩增。第一步PCR保 证了扩增的ABL激酶区位于BCR-ABL融合基因上，而第二步PCR特异性扩增整 个该激酶区，即包含第217到517位氨基酸。本次研究的IM耐药患者中，有14例患者检测到点突变，3例患者检测到35 bp 的插入。其中，T315I突变可以破坏IM与BCR-ABL
12、蛋白的结合6，是目前最难 克服的耐药突变，也是报道最多的点突变之一；而N358D、F359V、T389A、E450K、P441L、F486S并不破坏IM与BCR-ABL蛋白的结合，但可通过改变 ABL激酶的空间构象，阻碍IM与之结合6-7；其中1例未报道突变S410G，通过 SIFT以及蛋白质三维结构预测S410G点突变对蛋白质功能产生的影响，得知突变 位于activation loop区域的a-螺旋上，此区域的功能是控制酪氨酸激酶的活性， 因此推测突变可能对酪氨酸激酶调控起作用。2008年后，在CML Ph+患者中关 于C475YfsX11突变报道越来越多8,但国内尚无报道。本实验在耐药患者
13、中检 测到3例C475YfsX11突变，此类突变由于在ABL夕卜显子89之间插入35 bp , 造成插入位置后移码突变，使翻译自插入点开始插入10个氨基酸而提前终止翻译， 这个截短的BCR-ABL蛋白由于缺少了 ABL C-末端核酸序列、DNA绑定和肌动蛋 白绑定结构域，从而对整个蛋白质功能产生影响。但对此还有争议9-10,还需要 进一步的临床试验予以证实。由于本次研究样本较少，仅对56例使用IM治疗的 耐药患者进行分析，为获得更多的耐药相关信息，指导临床治疗，还需扩大样本量 深入研究。4参考文献1 Nicolini FE, Corm S, Le QH, et al. Mutation sta
14、tus and clinical outcome of 89 imatinib mesylate-resistant chronic myelogenous leukemia patients: a retrospective analysis from the French intergroup of CML (Fi(phi)-LMC GROUP)J. Leukemia, 2006,20(6): 1061-1066.2 张之南.血液病诊断及疗效标准M.北京:科学出版社,2007:134-1386.3 Baccarani M, Saglio G, Goldman J, et al. Evolv
15、ing concepts in the management of chronic myeloid leukemia: recommendations from an expert panel on behalf of the European Leukemia NetJ. Blood, 2006,108(6): 1809-1820.4 Ng PC,Henikoff S. SIFT: Predicting amino acid changes that affect protein functionJ. Nucleic Acids Res, 2003, 31(13): 3812-3814.5
16、Gorre ME, Mohammed M, Ellwood K, et al. Clinical resistance to STI-571 cancer therapy caused by BCR-ABL gene mutation or amplificationJ.Science, 2001,293(5531): 876-880.6 Chu S, Xu H, Shah NP, et al. Detection of BCR-ABL kinase mutations in CD34+ cells from chronic myelogenous leukemia patients in c
17、omplete cytogenetic remission on imatinib mesylate treatmentJ. Blood, 2005,105(5): 2093-2098.7 Jabbour E, Cortes JE, Kantarjian H. Second-line therapy and beyond resistance for the treatment of patients with chronic myeloid leukemia post imatinib failureJ. Clin Lymphoma Myeloma, 2009, 9 (S uppl 3):
18、S272- 279.8 Lee TS, Ma W, Zhang X, et al. BCR-ABL alternative splicing as a common mechanism for imatinib resistance: evidence from molecular dynamics simulationsJ. Mol Cancer Ther, 2008,7(12): 3834-3841.9 Khorashad JS, Milojkovic D, Reid AG. Variant isoforms of BCR-ABL1 in chronic myelogenous leukemia reflect alternative splicing of ABL1 in normal tissue-letterJ Molecular Cancer Therapeutics, 2010,9(7): 2152- 2152.10 Santamaria I, Pitiot AS, Balbin M. ABL alternative splicing is quite frequent in normal population-letterJ Molecular Cancer Therapeutics, 2010,9(3): 772-772.
伊马替尼耐药CML患者ABL基因激酶区突变检测
