抗生素微生物检定方法学验证中的常见问题分析

《抗生素微生物检定方法学验证中的常见问题分析》由会员分享，可在线阅读，更多相关《抗生素微生物检定方法学验证中的常见问题分析（5页珍藏版）》请在装配图网上搜索。

1、发布日期 02栏目化药药物评价化药质量控制标题 抗生素微生物检定措施学验证中的常用问题分析 作者 审评三部部门 正文内容 审评三部审评五室刘英摘要：本文对抗生素微生物检定法中的管碟法在措施学验证中的常用问题如线性与范畴中溶液浓度与直径的关系、精密度的测定措施等进行了分析,归纳其错误的问题,给出了对的的操作措施。核心词: 抗生素微生物检定法多组分抗生素措施学验证抗生素微生物检定法是国际上通用的、典型的抗生素测定措施。自世纪40年代建立至今,在各国药典中被普遍采用。虽然随着着HPLC等化学分析技术的发展,某些抗生素品种的效价已被化学分析法所取代，但由于微生物检定法可直观、特异地反映出抗生素品种的抗

2、菌活性；多组分抗生素由于构造与不同活性组分生物活性的差别，化学测定成果难以精确表征组分构成、含量和生物活性间的关系;许多抗生素品种由于多种因素如无特性紫外吸取等，目前没有合适的化学分析措施表征其活性，故抗生素微生物检定法目前在各国药典中仍占有重要的地位，且短期内化学分析法不也许完全取代微生物检定法。中国药典仍采用抗生素微生物检定法中的管碟法测定其效价,目前申报已有国标的该类制剂较多,在质量研究中存在诸多问题,现就常用的问题加以分析,但愿对注册申请人有所协助。一、措施的建立、供试品与原则品的同质性 抗生素微生物检定法的原理以供试品与原则品同质为前提，措施建立前,一方面应拟定供试品与原则品与否同质

3、，涉及化学构造、所含组分及组分比例的一致性，对于制剂还要考虑辅料的影响与否导致供试品与原则品不同质。、培养基、实验菌、缓冲液和培养条件的选择可参照中国药典建立,在此不再赘述。3、检定措施的拟定可采用一剂量法(原则曲线法)、二剂量法及三剂量法等。一般拟定线性与范畴采用一剂量法（原则曲线法），常规含量测定采用二剂量法,原则品标定采用三剂量法。 4、抗生素溶液的稳定性选定的品种可参照中国药典现行版附录抗生素微生物检定法的品种,若溶剂和缓冲液与其不同,应考察抗生素储藏溶液和测定溶液在室温、40和不同pH值缓冲液中，以及放置不同步间的稳定性，以拟定抗生素储藏溶液和测定溶液的寄存时间和条件。 二、措施的验

4、证验证的目的是证明采用的措施适合于检测的规定。验证内容有:精确度、精密度(涉及反复性、中间精密度)、专属性、合用性和线性。在申报资料中常用的错误有:线性测定不符合抗生素微生物检定法一剂量中心浓度等比测定的原理;精密度的测定措施不对的；无专属性实验。下面就措施验证的内容与常用的错误加以简述。1、专属性 考察杂质、辅料等对测定成果精确性的影响,可通过如下实验验证：(1) 用辅料等替代抗生素进行实验，应不产生抑菌作用。（2) 采用回收率实验进行验证，至少有9对以上数据,并进行明显性检查。2、线性线性系指在设计的范畴内，测试成果与试样中被测物浓度直接呈正比关系的限度。做抗生素微生物检定法实验时，被测物

5、浓度应转换为对数浓度。管碟法中抗生素溶液浓度的对数值与抑菌圈直径或面积之间的关系在一定的浓度范畴内，应呈线性关系。用一剂量法测定。 、测定措施 （1)拟定直线中心点的抗生素浓度。中心点浓度C 0应使所致抑菌圈的直径在118m。(2）线性测定的剂距一般用等比级数,可选用1:0.80、1:085或1:0.88等，稀释成合适的浓度系列。(3)每个浓度为一组，至少设8组，一般每组5个双碟，每组双碟数m应相等。(4)管碟法的线性考察,其直线的最低浓度端与最高浓度端的拟定，应选择比所致抑菌圈直径在82mm高的浓度为最高浓度,即高浓度应涵盖能致抑菌圈直径在22m的浓度。按中心浓度等比的关系,求算最低浓度。但

6、最低浓度端应涵盖含量(效价）测定期高、低剂量之比为:1的低剂量浓度。(5)取制备好底层及菌层培养基的双碟，每35个双碟为一组,共分组（6)各组滴加完毕后，将双碟在规定温度下培养一定期间，测定各抑菌圈直径。(7)以各组浓度C的对数值lg与相相应各浓度的直径与中心点浓度直径的差值作线性分析,得回归方程及有关系数，并对有关系数作明显性检查,同步绘制线性图。、常用错误（1）直接以浓度与直径作线性关系图。(2)虽然以抗生素溶液浓度的对数值与抑菌圈直径作线性关系图,但不是等比系列,如浓度设计为:、3、4、5、6、7u/ml等。以上两种现象显然违背抗生素微生物检定法的原理，也不也许得出直线关系。(3)抑菌圈

7、直径太大或太小：不小于24mm或不不小于1均不正常。如：效价测定中高浓度溶液所制的抑菌圈直径不小于6时已超过双碟的直径范畴而无法测量，低浓度溶液所制的抑菌圈直径不不小于14mm时,其浓度的对数剂量与直径已不成线性,而在线性研究中成果为抑菌圈直径在5m35m范畴内与浓度的对数剂量线性关系良好，显然上述数据是不符合实际状况的。（4）以浓度与效价建立线性关系。如：剂量浓度(u/ml）0.0 0.01.021 0.020.0402 0.502 0.1004该措施显然不符合抗生素微生物检定措施学中线性的含义,线性是指滴加抗生素溶液的浓度与所致抑菌圈直径或面积的关系，若以浓度与效价建立线性关系,则是运用已

8、建立好的措施去测定含量的高下，而非对措施自身进行验证。况且由于高下剂量相差较大，低者仅为1uml,高者达50u/m，也也许不在同一线性范畴。以上几种成果均不是从真实实验得到，也无法进行实际实验操作。、精确度(回收率) 精确度系指用该措施测定的成果与真实值接近的限度，一般用回收率（)评价。精确度验证，可根据具体实验状况选择如下实验措施。回收率实验一般用至少9次测定成果进行评价，按标示量的8%、100、120分别投入已知量的被测物，分别测定3次。标示量的、10%的回收率可在线性范畴内调节原则品的剂量,使其满足抗生素微生物检定法的规定。应报告己知加入量的回收率或测定成果平均值与真实值或承认参照值之差

9、及其可信限。模拟回收率实验：按处方成分和比例,分别加入敷料和已知量的被测物，测定回收率。加样回收率测定:如不能得到制剂的所有组分,可先测定制剂中被测物的量后，再加入己知量的被测物，根据被测物的原含量和加入量，计算回收率。、 精密度 、测定措施 反复性实验 至少用9次测定成果进行评价，如制备80、100、1三个不同浓度的样品，各测定3次进行实验，其中80和120%浓度按抗生素微生物检定法的规定，重新估计效价后进行测定，再折算测定成果。或把被测物浓度当作10%,至少测定6次的成果进行评价。中间精密度 考察测定成果的日间差、不同分析人员之间的测定成果的差别。、常用错误以一种浓度点反复测定n次,得到个

10、抑菌圈直径数据，对抑菌圈直径直接进行记录分析,RSD%成果常常是不不小于2%。例:浓度5um,直径测定成果：1675、17.0、1.8、16.5、17.02、16.55，RS 1.2%.由于管碟法碟间差别很大，需通过记录分析分除碟间差别才干得到含量测定成果，此种措施不仅不符合抗生素微生物检定法的原理，在实验中也得不到这样的成果。对的的措施应是对不同次的效价测定成果进行记录分析。5、耐用性合用性系指测定条件有较小的变动时,测定成果不受影响的承受限度,成为该措施可用于提供常规检查的根据。如果测定条件苛刻，则应注明。管碟法重要考察不同来源及批号的培养基、培养基的pH值、缓冲液的p值及抗生素溶液稳定性等对测定成果的影响。由于一般均为已有国标的注册品种，措施较成熟,目前对抗生素微生物检定法措施学验证中耐用性进行考察的较少