吉林大学生命科学学院生物化学.ppt

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1、3.6 肽健将氨基酸连接成蛋白质 3.7 蛋白 质纯 化技 术 3.6 Peptide bonds link amino acids in proteins 3.7 Protein Purification Techniques 多肽的 双缩脲反应 (Biuret reaction)是 多肽特有 的颜色反应 ;双缩脲是 两分子的尿素经加热失去一分子 NH3而得到的产物 。 双缩脲 能够与碱性硫酸铜作用，产生兰色的铜 -双缩脲络合物，称为 双缩脲反应 。含有 两个以上肽键 的多肽，具有与双缩脲相似的结构特点， 也能发生双缩脲反应，生成 紫红色 或 蓝紫色 络合物。 这是多肽定量测定 的重要反应。

2、 3.6 肽 健 将氨 基酸 连 接成蛋白 质 1. 肽键的发现 : 3.6 Peptide bonds link amino acids in proteins 1. Discovery of peptide bond: NH3 加热 + 紫红色 络合物 肽键 连接氨基酸的键，是一个次级的酰胺键 有一个氨基酸的 a羧基 和另一个氨基酸的 a- 氨基 缩合而成 (丢掉一个 H2O) 初级结构 一个多肽或蛋白质的线性顺序 Peptide bond - linkage between amino acids is a secondary amide bond Formed by condensat

3、ion of the a-carboxyl of one amino acid with the a-amino of another amino acid (loss of H2O molecule) Primary structure - linear sequence of amino acids in a polypeptide or protein 2. 多肽链的命名 氨基酸 “残基 ” 组成多肽链 肽链排序从 N (氨基 ) 端到 C (羧基 )端 Example: (N) Gly-Arg-Phe-Ala-Lys (C) (or GRFAK) 肽链的形成是消除游离氨基酸的 a-羧基

4、和 a-氨基 = 侧链主要形成氨基酸的电荷、溶解度和形状 2. Polypeptide chain nomenclature Amino acid “residues” compose peptide chains Peptide chains are numbered from the N (amino) terminus to the C (carboxyl) terminus Example: (N) Gly-Arg-Phe-Ala-Lys (C) (or GRFAK) Formation of peptide bonds eliminates the ionizable a-carbo

5、xyl and a-amino groups of the free amino acids = side chains contribute mostly to the protein charge, solubility , and shape 寡肽 (最多约 20氨基酸 ) 多肽 (超过 20氨基酸 ) Oligopeptide (up to about 20AA) Polypeptide (usually more than 20AA) 蛋白质中大多数电荷是由侧链形成的 Most of the ionic charges in proteins are contributed by s

6、ide chains of AAs L-Leu-D-Phe-L-Pro-L-Val L-Orn L-Orn L-Val-L-Pro-D-Phe-L-Leu 短杆菌肽 S(环十肽 ) 由细菌分泌的多肽 ， 有时也都含有 D-氨 基 酸 和 一 些 非 蛋 白 氨 基 酸 。 如 :鸟 氨 酸 （ Ornithine, 缩写为 Orn） 。 阿斯巴甜是一种比食糖甜二百倍的甜味剂 . Aspartame is a sweetening agent which is about 200 times sweeter than table sugar. 3.7 蛋白质纯化技术 大体 过 程 : 1. 准

7、备 蛋白 质 溶液 ; 2. 粗分 馏 (分离 ); 3. 精分 馏 (分离 ); 步骤越少越好 时间越短越好 3.7 Protein Purification Techniques in as few steps as possible in as short a time as possible General procedure: 1. Preparing a solution of proteins; 2. Crude fractionation (separation); 3. Fine fractionation (separation); Basic Pr inc ipl es

8、o f Pr ot ein Pur ifica t i on Am m oni um sul f a t e f ra c t i ona t i on C e ll Org an el l e Ho m og en i z ati on M ac r om olecu le Nu cl e i c a ci d C ar boh yd r at e ( L ipid ) Si ze Ch arg e Pol arit y Af f in it y S m a l l m o l e cul e C el l D eb r is Pr ot ein A m i n o a c i d , S

9、u g a r , N u c l e o t i d e s , e t c Ge l f i l tra t i o n , S DS - P A GE , Ultraf i l tra tion Io n e xc h a n g e , Ch rom a to fo cusi n g , Dis c - P A GE , Iso e l e ctri c f o cu si n g Re verse p h a se chro m a to g rap h y, HIC , S a l ting - out A ff i n i ty chro m a to g rap h y , H

10、yd rox yap a tite J u a n g R H (2 0 0 4 ) B C b a s i c s A. 准 备 蛋白 质 溶液 物理法 冻融法 ， 超声波法 ， 均浆法 ， 研磨法等 。 酶裂解法 就是利用水解酶将细胞壁和细胞膜消化 的方法 ， 常用的水解酶有溶菌酶 、 葡聚糖酶 、 蛋白酶 、 糖苷酶 、 壳多糖酶 、 细胞壁溶解酶等 。 其中溶菌酶 主要对细菌类有作用 ， 其他酶对酵母作用显著 。 A. Preparing a solution of proteins 超声波均质器 Ultrasonic homogenizer B. 蛋白质的纯化方法 1. 根据溶解度不

11、同纯化 ; 2. 根据分子质量（大小）纯化 ; 3. 根据电荷不同纯化 ; 4. 根据蛋白质与其它物质的相互作用纯化 ; B. Purification methods of proteins 1. Purification methods according to difference of solubility; 2. Purification methods according to difference of molecular mass (size); 3. Purification methods according to difference of charge; 4. Puri

12、fication methods according to the interaction of a protein with other compounds; 1. 根据溶解度不同纯化 (1) 等电点沉淀法 (2) 盐溶与盐析 W=505（ S2S1） /（ 10.285S2） V = 100（ S2S1） /（ 1S2） (3) 有机溶剂沉淀法 (4) 加热沉淀法 1. Purification methods according to difference of solubility (1) Isoelectric precipitation (2) Salting in and Sal

13、ting out W=505（ S2S1） /（ 10.285S2） V = 100（ S2S1） /（ 1S2） (3) Organic solvent precipitation (4) Heating precipitation + = - + = - 盐溶 （ Salting-in） Ionic strength 溶 解 度 + - NaCl NaCl KCl - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 分子在其等电点时，容易互相吸引，聚合成沉淀；加入 盐离子会形成双电层

14、破坏这些吸引力，使分子散开，溶入 水中。 Aggregate 蛋白质分子表面的疏水性区域，都聚集许多水分子，当盐类加入 时，这些水分子被抽出，以便与盐离子进行水合，水化层被破坏， 暴露出来的疏水性区域互相结合，形成沉淀。 盐析 （ Salting-out ） Ionic strength 溶 解 度 Ammonium sulfate Sodium sulfate A little salting-in effect N H 4 + S O 4 2- = hydrophobic 1. 降低水活性，使溶液的 介电常数下降 ，增加蛋白质溶质分子之间 的作用力，因而聚集在一起。 2. 去除水化层。 M

15、embrane protein 溶 解 度 Water-soluble protein - - - - - - + + + + + + + + + + - + - + + + + + - - - 有 机 溶 剂 Solvent % = hydrophilic 有机溶剂沉淀法（ Organic solvent precipitation） 2. 通过分子质量（大小）纯化 (1) 凝胶过滤层析（分子排阻层析 ) (2) 膜分离技术（层析及超滤法） (3) 密度梯度离心法 2. Purification methods according to difference of molecular mas

16、s(size) (1) Gel filtration chromatography（ molecular exslusion chromatography) (2) membrane separation technique（ Dialysis and ultrafiltration） (3) Density gradient centrifugation (1) 凝胶过滤层析 (1) Gel filtration chromatography Vt = Vo + Vi + Vm Vi + Vm= Vt Vo Kd =（ Ve Vo） / Vi Ve Vo = a b logM logM =

17、K1 K2 Ve 分部收集器 紫外监测仪 记录仪 胶柱的装填方法： 缓 冲 液 平 衡 温 度 平 衡 静 置 胶 体 清 洗 胶 体 预 估 体 积 装 填 胶 体 暂 停 流 洗 X 继 续 流 洗 加上 reservoir 已 堆 积 沉 积 中 上 清 加 压 流 洗 加上 adaptor 紧 密 堆 积 检 查 好 管 柱 是 否 畅 通 1 2 Gel Gel 常用凝胶过滤介质 Sephadex：交联葡聚糖，是采用环氧氯丙烷作交联剂将 右旋葡聚糖交联而成。干粉容易膨胀，在水、盐溶液、 有机溶液、碱和弱酸中化学性质稳定，可高压灭菌。高 交联度的 Sephadex，其颗粒坚硬，适于高流

18、速下操作。 Sephacryl : 烯丙基葡聚糖 同 N、 N 甲叉双丙烯酰胺共 价交联而成。颗粒坚硬，性质比 Sephadex更为稳定，可 高压灭菌，在 pH311条件下稳定，可用有机溶剂洗脱， 也可用 SDS、尿素及盐酸胍洗脱。 Sepharose：琼脂糖凝胶，是将琼脂糖溶液冷却，多 糖链形成双螺旋，凝集成束，自发的形成稳定的珠状 颗粒。琼脂糖由氢键维系，在 pH49条件下稳定，超 过 40 熔化，冷冻出现珠状破坏。 可分为 Sepharose 2B、 4B、 6B（即含琼脂 2%、 4%、 6%）。 Sepharose CL 又称交联琼脂糖，是 Sepharose 同 2， 3-二溴丙醇

19、 在强碱下交联而成。在 pH311条件下稳定。 Sepharose Fast Flow 是经过 高度交联 的琼脂糖珠体， 大大增加了其机械强度，以流速快为特征。由于流速 快，所以工业规模使用。有极高的物理化学稳定性， 可用多种有机溶剂清洗，还可用 1-2mol/L的 NaOH进 行“原位清洗”。 琼脂糖凝胶的骨架结构 交联葡聚糖凝胶的骨架结构 凝胶的再生和保养 凝胶过滤柱一般可多次使用，无需特殊的再生处理。但当多次使 用后，凝胶可能被压紧，流速变慢。这时需要重新填装。 葡聚糖凝胶和琼脂糖凝胶都是碳水化合物，能被微生物（如细菌 和霉菌）分解。为防止细菌生长和发酵，可用 0.02%叠氮钠 等防 腐

20、剂。层析前再用缓冲液将防腐剂洗去。 保存：短期保存，可在反复洗涤除去蛋白质等杂质后，加入防腐 剂；长期保存，则需将凝胶从柱中取出，进行洗涤、脱水和干燥。 方法是将凝胶用低浓度的酸或碱溶液短时间浸泡，再用水反复洗 涤除去杂质，过滤抽干，浸泡在 50%乙醇溶液中进行脱水。最终 浸泡在 75%乙醇中长期保存。 一些注意事项 为了提高分辨率，柱高应为柱直径的 20 40倍； 上样量应小于柱床体积的 5%，最大不应超过柱床体积的 10%，上 样的蛋白质样品浓度以不超过 4%为宜，浑浊样品需离心后上样。 洗脱时，流速要恒定。缓冲液的 pH值、离子强度等必须都有利于 蛋白质稳定；中等离子强度的缓冲液有助于消

21、除蛋白质与凝胶可 能产生的相互作用； Sephadex在使用前需要溶胀，一份凝胶加 10份水；在摇床上或手 动混合，避免使用电力搅拌器；待凝胶颗粒沉降后，去除上清， 重复几次，直到液相不再混浊为止；自然溶胀需 24h或几天，加热 可促进溶胀， 1 2h即可完成； (2)膜分离技术（层析及超滤法） (2) membrane separation technique Dialysis and ultrafiltration 膜分离技术 -微滤 微滤 主要用于除菌过滤 、 细胞收集和产品的澄清 ， 采用的 微滤 膜孔径为 0.1-10mm， 适用的驱动力为 0.1-0.5MPa。 采用微滤方法 ，

22、可做到封闭式操作 ， 不与环境产生交叉污 染 ， 所用设备投资少 ， 操作过程安全 ， 加工量可大可小等 优点 。 膜分离技术 -超滤（ ultrafiltration） 超滤 主要用于大分子物质的分离 、 浓缩 、 除盐和改变缓冲体系等 ， 可分 离分子量从 300 1,000,000Da的可溶性大分子物质 ， 在以截留的浓缩液 为产物时 ， 可达到浓缩的目的在浓缩大分子物质时 又可同时除去无机 盐及小分子不纯物 。 超滤膜孔径为 0.001-0.1mm， 适用的驱动力为 0.2-1MPa。 超滤具有膜材料本身无毒性 ， 在操作中不溶出有害物质 ， 故对终产品不 会产生不利影响 ， 可在室温

23、或低温条件下操作 ， 适于热敏感物质的分离 浓缩；化学强度及机械损害最小 ， 减少失活；系统可密闭循环 ， 防止外 来污染；处理效率高 ， 设备经济简单等优点 。 进液管 封闭管 弃液管 回流管 卷式超滤器 中空纤维超滤器 膜包 (3) 密度梯度离心法 (3) Density gradient centrifugation 离心沉降技术 离心沉降是利用固体和液体之间的 密度差 将两者分离 ， 一般来说细胞 、 细胞碎片 、 蛋白质沉淀物及病毒颗粒的 密度都大于其相应的液体环境 ， 可以利用离心的方式使 其沉降 。 沉降的难易取决于几种因素： 密度差 越大 ， 离心沉降速 度越快；在密度差存在的

24、条件下 ， 分子的质量 越大 ， 沉 降速度越快 ， 但 体积 大的分子出于阻力大 ， 会影响其沉 降速度； 液体的粘稠度 越大越不容易离心 。 Sedimentation coefficient (s) s = dx/dt /2r 1S (Svedberg) =10-13 秒 s=V (D-D)/f ， V-被离心物质的体积， D-D-分离物和溶液的密度差， f为摩擦系数， 离心沉降技术 离心机按转速可分为： 普通离心机 (500一 4000rpm)、 高速离心机 (800一 25000rpm)、 超速离心机 (25000 80000rpm)和超高速离心 机 (150000rpm)。 分子量

25、大于 108者可用高速和普通离心机 ， 106- 108者应选用超速离心机 ， 而小于 106者用离心和超速离心效果不 好 。 利用离心机分离物质主要采用两种方式： 沉降速度法 和 沉降平衡 法 。 离心沉降技术 沉降速度法 主要用于分离沉降系数不同 (相差达一个数量 级以上 )的物质 ， 这种方法采用差速离心 ， 逐步分级增大离 心力 ， 开始在一个较低的速度下离心 ， 使可溶物和不溶物 分开 ， 取上清后加大离心速度 ， 使某些沉降系数大的物质 沉淀 ， 然后再次去上清 ， 加大离心力 ， 再次获得另一种物 质沉淀 ， 如此反复多次 ， 使不同物质按沉降系数不同逐级 分开 。 离心沉降技术

26、 沉降平衡法 当两种物质的沉降系数差别不到一个数量级 时 ， 用沉降速度法很难分开 ， 这时要借助于沉降平衡法来 获得比较满意的分离效果 ， 常用的为 密度梯度离心法 。 这 种方法的原理是人为造成离心管中不同的密度环境 ， 使介 质的最大密度大于分离物的最大密度 ， 这样分离物在离心 力的作用下 ， 各自停留在与其密度相当的区域 ， 从而达到 分离的目的 ， 这一方法的要点是离心时间要足够 ， 离心后 分层收集 。 台式离心机 大容量离心机 超速离心机 超高速离心机 3. 根据电荷不同纯化 (1) 离子交换色谱法： (2) 聚丙烯酰胺凝胶电泳（ PAGE） (3) 等电聚焦电泳（ IEF）：

27、 3. Purification methods according to difference of charge (1) Ion exchange chromatography： (2) Polyacrylamide gel electrophoresis（ PAGE） (3) Isoelectric focusing electrophoresis（ IEF）： (1) 离子交换色谱法 (1) Ion exchange chromatography 离子取代优先顺序 + + + + + + + + + + + + + + + + + + 电荷高者 离子大者 浓度大者 离子交换层析类型 强

28、酸型：磺乙基、磺丙基 阳离子交换树脂 中酸型：磷酸基 弱酸型：羧甲基 强碱型：三乙基氨基乙基、 阴离子交换树脂 二乙基（ 2羟丙基） 氨基乙基 中强碱型：二乙基氨基乙基 弱碱型：氨基乙基、对氨基苯甲基 蛋白质纯化常用的离子交换剂 蛋白质纯化常用亲水性离子交换剂。因为亲水性离子交换 剂对生物大分子物质的吸附和洗脱均较温和，被分离纯化 的物质不易被破坏。 纤维素类 ：纤维素离子交换剂是最早用于生物大分子分离 的介质，它具有松散的亲水网络，大孔隙、表面积大等优 点。但因以无定型为主，故很难用于层析柱操作。 DEAE- Sephacel 是经特殊交联处理制成的珠状离子交换纤维素。 蛋白质纯化常用的离子

29、交换剂 葡聚糖系离子交换介质 ：主要以 Sephadex系的产品为主， 它是在 Sephadex G25及 G50两种凝胶过滤介质上引入功能 基后，产生的多种离子交换介质。该类介质容量大，价格 较低，但由于流速、体积受外界影响较大，逐渐被新一代 的 BioProcess凝胶所代替。 琼脂糖系 （ agarose)：琼脂糖凝胶介质上引入功能基得到的 多种离子交换剂。其中，新一代 BioProcess系列凝胶，具有 流速高，载量大，理化稳定性好，可就地清洗，并可反复 使用，是目前使用最多的离子交换介质。 Test-tube methods for selecting ion exchange co

30、nditions (2) SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（ SDS- PAGE） 单体：丙烯酰胺，甲叉双丙烯酰胺 ; 交联剂： TEMED四甲基乙二胺 （ N,N,N,N-Tetramethylethylenediamine） ; 引发剂：过硫酸铵； 变形记： SDS十二烷基磺酸钠； 还原剂： -巯基乙醇 ; (2) SDS-Polyacrylamide gel electrophoresis （ SDS-PAGE） Monomer： acrylamide， Methylenebisacrylamide; Accelerator： TEMED （ N,N,N,N-Tetramethylethyle

31、nediamine） ; Initiator： Ammonium Persulfate； Denaturant： SDS； Reductant： -Mercaptoethanol; 染色： 1. 考马斯亮蓝 G-250 2. 银染色 Staining： 1. Coomassie brilliant blue G-250 2. Silver staining SDSPAGE logM = K1K2R (3) 等电聚焦电泳 （ IEF） (3) Isoelectric focusing electrophoresis （ IEF） Principle of IEF 10 or 20 Fractio

32、ns Ampholytes generate pH gradient (pH 3-10) 7.5 9.5 7.5 pI 4.5 7.5 7.5 7.5 pI 4.5 9.5 9.5 9.5 9.5 pI 4.5 3 4 5 6 7 8 9 10 Anode (+) Cathode (-) ACID BASE Proteins Migrate to their pI ( 0 net charge) 蛋白质向等电点迁移 10个或 20个片段 Principle of IEF 10 or 20 Fractions Harvest with Vacuum Source 7.5 9.5 7.5 pI 4

33、.5 7.5 7.5 7.5 pI 4.5 9.5 9.5 9.5 9.5 pI 4.5 3 4 5 6 7 8 9 10 Anode (+) Cathode (-) ACID BASE 二维电泳 2-D electrophoresis Condition A Condition B 3 4 7 10 pH + - - + SAMPLE PREPARATION FIRST DIMENSION SECOND DIMENSION STAINING IMAGING ANALYSIS & EXTRACTION MASS SPECTROMETRIC IDENTIFICATION OF SPOTS 2-D

34、 Expression Proteomics Methodology 蛋白质类型 蛋白质组学 研究一大类蛋白质 , 如一个细胞所产 生的所有蛋白质 大肠杆菌有大约四千种多肽 (每种多肽平均三百个 氨基酸 , 分子量 33,000) 果蝇 (Drosophila melanogaster) 大概 16,000个 , 人类和其他哺乳动物 大概 40,000 种不同肽链 Types of proteins Proteomics - study of large sets of proteins, such as the entire complement of proteins produced b

35、y a cell E. coli has about 4000 different polypeptides (average size 300 amino acids, Mr 33,000) Fruit fly (Drosophila melanogaster) about 16,000, humans, other mammals about 40,000 different polypeptides 4.根据蛋白质与其它物质的相互作用纯化 （ 1） 亲和色谱法 ： (2) 吸附 : (3) 疏水层析 : 4. Purification methods according to inter

36、action of a protein with other compounds (1) Affinity chromatography ： (2) Adsorption : (3) Hydrophobic chromatography: 固相载体 (1) (2) (3) A B Sample Washing Elution X B 亲和基团 配体 X B A A （ 1）亲和色谱法 （ 1） Affinity chromatography Typical affinity purification 金属螯合亲和层析 ，其原理是利用蛋白质表面的一些氨基 酸，例如 :组氨酸等能够与多种过渡金属离

37、子如 Cu2+， Zn2+ ， Ni2+， Co2+， Fe3+发生特殊的相互作用，利用这个原理 对蛋白质加以分离。因此偶联了合适金属离子的琼脂糖凝 胶就能够选择性的吸附那些含有组氨酸的蛋白和对金属离 子有吸附作用的多肽、蛋白和核苷酸。半胱氨酸和色氨酸 也能与固定金属离子产生结合作用，但这种结合力要远小 于组氨酸残基与金属离子的结合力。 (2) Adsorption -羟基磷灰石 （ 3）层析技术 -疏水层析 （ Hydrophobic Interaction Chromatography， HIC） 疏水作用层析是根据分子表面疏水性差别来分离蛋白质和多肽等生物 大分子的一种较为常用的方法。蛋白质和多肽等生物大分子的表面常常暴 露着一些疏水性基团，我们把这些疏水性基团称为疏水补丁，疏水补丁可 以与疏水性层析介质发生疏水性相互作用而结合。不同的分子由于疏水性 不同，它们与疏水性层析介质之间的疏水性作用力强弱不同，疏水作用层 析就是依据这一原理分离纯化蛋白质和多肽等生物大分子的。 疏水层析流程 高压液相色谱 High Pressure Liquid Chromatography 纯化结果及纯度 Results of purification and purity