双向电泳原理与流程

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1、1 / GE Title or job number / 2/20/2021 万 翔 Xiang.wange.co m 18675966958 双 向 电 泳 技 术 2 / GE Title or job number / 2/20/2021 Proteomics “ .the analysis of complete complement of proteins. Proteomics includes not only the identification and quantification of proteins, but also the determination of thei

2、r localization, modifications, interactions, activities, and, ultimately, their function. Stanley Fields, University of Washington, Seattle, in Science 291, 1221 (2001) 3 / GE Title or job number / 2/20/2021 Proteomics 一个细胞在特定生理或病理状态下表达的所有种类的蛋白质称 为蛋白质组 (proteome) 仅仅从基因组学水平上无法彻底的了解各种生命现象 , 因为蛋 白质才是生命

3、活动的真正执行者 从基因组学上我们无法检测到转录后修饰、翻译调节、选择性 剪切、以及蛋白复合物形成、蛋白质相互作用等生命现象 ; 此 外并不是细胞内的所有的 DNA都翻译转录成蛋白质 4 / GE Title or job number / 2/20/2021 Proteome Analysis and Proteomics The analysis of the entire PROTEin complement expressed by a genOME, or by a cell or tissue type. Wasinger VC et al, Electrophoresis 16

4、(1995) “ Proteomics is the study of quantitative changes of expression levels and their application to drug discovery, diagnostics and therapy.” Two basic technologies: 2-D electrophoresis of complex protein mixtures Identification and structure analysis of proteins with mass spectrometry methods 5

5、/ GE Title or job number / 2/20/2021 Why 2DE? Only Proteomics is the large-scale screening of the proteins of a cell, organism or biological fluid, a process which requires stringently controlled steps of sample preparation, 2-D electrophoresis, image detection and analysis, spot identification, and

6、 database searches. The core technology of proteomics is 2-DE. At present, there is no other technique that is capable of simultaneously resolving thousands of proteins in one separation procedure. 6 / GE Title or job number / 2/20/2021 理论 pI and Mr 图 酵母细胞表达 6,216种蛋白 1 10 100 1000 2 4 6 8 10 12 14 p

7、I (理论值 ) M r kDa 2DE 工作范围 注 : 图片中没有特别强调蛋白丰度和疏水性 至今 1,484个蛋白被鉴定 (Nat.Biotechnol. 17,676 and 19, 242) From: Wildgruber et al. Electrophoresis 21 (2000) 2610-2616. 7 / GE Title or job number / 2/20/2021 2D 电泳优越性 对未处理样本耐受性好 - 不需要预纯化 (如：色谱层析 ) 分辨率非常高 2D 可以有效的组分收集器 蛋白在凝胶介质中受到保护 在蛋白质组学技术中应用范围最广（ front-end

8、） 与其他技术相比，在一次试验中可检测到的蛋白点更多 与后续分析技术兼容性好 (如 . MDLC) 8 / GE Title or job number / 2/20/2021 蛋白质组学应用举例 研究细胞结果功能和分子组成 发现新的药物靶位点 发现新型生物学活性的分子和药物 差异蛋白质组学 发现细菌、病毒感染和疾病监测的分子标志物 修饰蛋白质组学 遗传或药理学扰动的分子解剖 病理生理学研究 中药机理 相互作用蛋白质组学 研究药物作用方式和毒性机理 植物抗虫抗旱抗逆 遗传育种和分子育种 资源环境 海洋生物 9 / GE Title or job number / 2/20/2021 寻找差异蛋

9、白质 环孢素 A处理前 环孢素 A处理后 正常 组织 肿瘤组织 细 胞 组 织 Life Sciences 的历史 LKB 电泳发明者 Pharmacia 层析技术开创者 Amersham Biosciences 提供基因组、蛋白组学研究整体解决方案 GE Healthcare Life Sciences 实现从发现到功能研究，从体外到体内的突破 11 / GE Title or job number / 2/20/2021 GE Healthcare milestones in 2-D electrophoresis LKB introduced Ampholine , the first

10、commercial carrier ampholyte The first multiple separation system, ISO-DALT, was developed Pharmacia Fine Chemicals introduced Pharmalyte LKB introduced Immobiline Pharmacia Biotech introduced Immobiline DryStrip Pharmacia Biotech introduced ImageMaster suite Pharmacia Biotech introduced IPGphor Pha

11、rmacia Biotech launched DALT II system Amersham Pharmacia Biotech launched Typhoon Amersham Biosciences launched Ettan DIGE The Multiphor flatbed electrophoresis unit is launched. In production for 30 years in 2003! 1967 1978 1979 1982 1991 1993 1998 2000 2000 2002 1973 12 / GE Title or job number /

12、 2/20/2021 2 DE 在蛋白质组学方 案中所处的位置 Fu n c tio n a l a n a ly sis S ta te 1 S ta te 2 2 DE PM F M S/M S LC - M S/M S Data ba s e s e a rch Diffe ren tia l a na l y s is ? 13 / GE Title or job number / 2/20/2021 Image analysis Image acquisition Automated spot picking Spot digestion MALDI target spotting

13、LWS Laboratory workflow system MALDI-ToF Protein Separation Proteomics 2DE Workflow Sample Prep Sample labeling 14 / GE Title or job number / 2/20/2021 小鼠肝脏蛋白提取物 2D凝胶电泳 2-D electrophoresis gel from Prof. Dr. A. Grg, Technical University Munich, Germany 15 / GE Title or job number / 2/20/2021 2D/MS 经

14、典工作流程 细胞裂解 匀浆 预分级 除杂质 浓缩 定量 差异分析 双向电泳 第一向 第二向 图像获取 图谱分析 银染 考染 荧光 蛋白标记 样品制备 分离 染色 图谱分析 挖点 酶解 点靶 蛋白鉴定 体液 植物 微生物 组织 细胞 16 / GE Title or job number / 2/20/2021 样品制备 细胞破碎 蛋白沉淀 溶解 抑制蛋白酶活性 去除 - 核酸 - 脂类 - 盐，缓冲液，离子性小分子 - 不溶性物质 17 / GE Title or job number / 2/20/2021 2D/MS 经典工作流程 差异分析 图像获取 图谱分析 银染 考染 荧光 蛋白标记

15、染色 图谱分析 挖点 酶解 点靶 蛋白鉴定 体液 植物 微生物 组织 细胞 Separation 双向电泳 第一向 第二向 细胞裂解 匀浆 预分级 除杂质 浓缩 定量 样品制备 18 / GE Title or job number / 2/20/2021 Principle of 2-D Electrophoresis 1. First dimension: denaturing isoelectric focusing separation according to the isoelectric point 2. Second dimension: SDS electrophoresis

16、 separation according to the molecular weight 2-D electrophoresis resolves a few thousand protein spots. 19 / GE Title or job number / 2/20/2021 等电聚焦电泳原理 蛋白质是带有电荷的两性生物大分子，其正负电荷的数量随所 处环境酸碱度的变化而变化。 20 / GE Title or job number / 2/20/2021 等电聚焦（ IEF） 电泳就是在凝胶中加入两性电解质，从而构成从正 极到负极 pH逐渐增加的 pH梯度，处在其中的蛋白分子在电场

17、的作用下运 动，最后各自停留在其等电点的位置上，测出蛋白分子聚焦位置的 pH值， 便可以得到它的等电点。 等电聚焦电泳原理 21 / GE Title or job number / 2/20/2021 双向电泳：传统方法 sample 胶在 SDS 缓 冲液中平衡 Principle according to P.H. OFarrell and J. Klose (1975) pH 10 pH 10 pH 3 pH 3 垂直胶管中进 行等电聚焦 urea, NP-40 一向 : 二向 : SDS 丙烯酰胺凝胶电泳 非连续梯度胶 按等电点分离（电荷） 按分子量分离（质量） 22 / GE Ti

18、tle or job number / 2/20/2021 使用载体两性电解质 IEF时存在的问题 不同批次载体两性电解质的重现性 载体两性电解质梯度不稳定 蛋白载量有限 重现性差导致梯度漂移 梯度漂移导致酸性和碱性蛋白质丢失 管胶柔软，尺寸不定 操作者个人技术影响结果 23 / GE Title or job number / 2/20/2021 固相凝胶 (支持膜上 0.5 mm 厚凝胶 ) 丙烯酰胺缓冲液 : Immobiline CH2=CH-CO-NH-R, R ： 羧基或叔胺基 固相 pH梯度 (IPG) 24 / GE Title or job number / 2/20/202

19、1 Immobiline 干胶条的特性 可重复性 无梯度漂移 , 真正的平衡方法 可分离酸性和碱性蛋白 容纳蛋白样本量更多 水平和垂直 SDS 凝胶中都能使用 允许样本水化上样 机械强度和尺寸稳定 易操作 易于对样本跟踪标记 25 / GE Title or job number / 2/20/2021 新 pH范围的 Immobiline 干胶条 高分辨率的 IPG 胶条，联合使用 DeStreak试剂 , 能改善 极碱 性区域 蛋白点结果 。 归功于独特的试剂。 使用 pH范围相互重叠的干胶条，可提高 2-D 图谱 分析效率 ! 新 pH范围 : Immobiline DryStrip p

20、H 3 5.6 NL Immobiline DryStrip pH 5.3 6.5 Immobiline DryStrip pH 6.2 7.5 Immobiline DryStrip pH 7 11 NL Immobiline DryStrip pH 3 11 NL 26 / GE Title or job number / 2/20/2021 不同 pH范围胶条 不同长度、多种窄 pH范围胶条可选，尤其是 1个 pH范围 pH7-11NL碱性胶条 27 / GE Title or job number / 2/20/2021 宽 pH 、窄 pH 范围胶条 宽 pH梯度胶条应用 : 整个蛋

21、白图谱 窄 pH梯度胶条应用 : 提高分辨率 增加样品上样量 检测分析更多蛋白 pH 3 4 5 6 7 8 9 10 4 5 6 7 8 9 28 / GE Title or job number / 2/20/2021 提高分辨率 : 斑点显现 IPG 4-7 IPG 5-6 IPG 4-7 IPG 5.5-6.7 Mouse liver proteins From A. Grg et al. (1999) 29 / GE Title or job number / 2/20/2021 不同长度的胶条 7 cm 11 cm 13 cm 18 cm 24cm 30 / GE Title or

22、 job number / 2/20/2021 线形与非线形胶条 for most samples Cell lysates Tissue extracts linear (L) nonlinear (NL) for samples with abundant proteins in the range between pH 5 and 7 Serum proteins 31 / GE Title or job number / 2/20/2021 pH 3-10 L and NL from Prof. Angelika Grg, Technical University Munich Tis

23、sue Proteins from Mouse Liver linear (L) nonlinear (NL) 32 / GE Title or job number / 2/20/2021 The IPGphor Platform 33 / GE Title or job number / 2/20/2021 IPG 胶条 水化 34 / GE Title or job number / 2/20/2021 IPG strip rehydration 如果水化时加入样品， 此体积是加入样品后的终体积 35 / GE Title or job number / 2/20/2021 加样品到胶条

24、槽 36 / GE Title or job number / 2/20/2021 泡涨盘 VS 聚焦盘 37 / GE Title or job number / 2/20/2021 干胶条的水化 主动水化：胶条槽内进行，大分子蛋白更容易进入胶条； 30 120V， 10 24Hrs 被动水化：专用水化盒中进行 NEW！ 无需覆盖油！ 避免灰尘污染，空气作用 不透明盖子，适用于 CyDye DIGE标记 同时适用于市场上所有 7 24cm干胶条的水化 38 / GE Title or job number / 2/20/2021 在样品杯中加入少量不含样品的水 化液检查是否漏液。上样前吸走水

25、化 液。 上样前将样品离心去掉不溶物，每 个样品杯最多可加样 150l。 盖上胶条槽的盖子，再盖 IPGphor 仪器的盖子。 分别将两个 IEF 电极片放在 IPG 胶条 胶的两端，分别将电极压在两个电极片 的外缘。 样品杯可放在两个电极间除胶条槽内 侧凸起外任何位置，对于碱性分离范围 的 IPG 胶条，尽量将样品杯靠近阳极放 置 . 杯上样 & 纸桥上样 39 / GE Title or job number / 2/20/2021 IEF电泳 IPGphor 包括半导体温控系统 (20 C)和程序化电源 (10000V) 可同时进行 12根胶条的等电聚焦 聚焦效果以“ Vh”数控制，可提

26、高 重复性 40 / GE Title or job number / 2/20/2021 IPG 胶条的平衡 两步平衡 SDS 电泳前 , 平衡母液 : 2% SDS, 50mM Tris-HCl pH 8.8, 6M urea, 30% glycerol + 蛋白与 SDS结合 甘油和尿素降低电内渗作用 第一步 DTT平衡 ： (1 x 15min) 1% DTT 第二步 碘乙酰胺平衡 ：去除多余的 DTT ， 防止拖尾 (1 x 15min) 2.5% iodoacetamide 41 / GE Title or job number / 2/20/2021 第二向垂直电泳系统 琼脂糖覆

27、盖密封 放置 IPG strip 低熔点琼脂糖 42 / GE Title or job number / 2/20/2021 Push the IPG Strip Down onto the Gel Surface 43 / GE Title or job number / 2/20/2021 Seal the Cassette and Fix the IPG Strip with Agarose 44 / GE Title or job number / 2/20/2021 Inserting the Cassette 45 / GE Title or job number / 2/20/

28、2021 SDS-PAGE 参数 46 / GE Title or job number / 2/20/2021 SE600ruby 47 / GE Title or job number / 2/20/2021 Ettan DALTsix 48 / GE Title or job number / 2/20/2021 Ettan DALTtwelve system 49 / GE Title or job number / 2/20/2021 第二向系统 strip gel number running length (cm) size (cm) of gels time (hr) Etta

29、n Dalt12 18, 24 25 x 20 12 4.5 Ettan Dalt6 18, 24 25 x 20 6 4.5 SE 600 2 x 7, 13 14 x 16 (24) 4 4 MiniVE 7 8 x 7, 8 x10 2 1.5 Multiphor II 7, 11 24 x 11* 1 1.5 18 24 x 18 1 3.3 PhastSystem (4)* 4 x 4 2 0.5 * 2 or 3 strips side-by-side * cut or home-made strip 50 / GE Title or job number / 2/20/2021

30、2D/MS 经典工作流程 差异分析 图像获取 图谱分析 蛋白标记 图谱分析 挖点 酶解 点靶 蛋白鉴定 体液 植物 微生物 组织 细胞 分离 细胞裂解 匀浆 预分级 除杂质 浓缩 定量 样品制备 双向电泳 第一向 第二向 银染 考染 荧光 染色 51 / GE Title or job number / 2/20/2021 Protein Detection Methods Se nsiti v ity li mit Qu antitation Li v in g ce ll s Li nea r Dy nam ic Ra ng e Co om as si e Bl ue stai ni ng

31、 10 0 n g + no 3 Ne ga tive st ai ni ng 15 ng + no 3 Si lv er stai ni ng 20 0 p g + no 7 Flu ore sce nt stai ni ng 40 0 p g + no 10 4 Flu ore sce nt labelling 2 50 pg + no 10 4 Ra di oa ctive labeling: X - ray f il m 1 p g + y es 20 Ph os po r - im ag er pl ate s 0.2 pg + y es 10 5 Stab le iso top e

32、 labelling 1 p g + (w ith MS) y es ? 52 / GE Title or job number / 2/20/2021 Coomassie Blue-考马斯亮蓝染色 + 灵敏度 ， 低至 0.01 mg (“胶体 ” 考染 ) + 非特异性染色 + 染料与蛋白成比例结合 + 线性化好 - 扩散速度受限，胶的厚度影响跑胶速度 - 纯度不够 - 有限的动力学范围 53 / GE Title or job number / 2/20/2021 胶体考马斯亮蓝染色 1 mg E. coli strain B IPGphor 24 cm pH 4 - 7 Colloid

33、al CBB G250 staining 54 / GE Title or job number / 2/20/2021 银染 + 灵敏度 ，低至 0.2 ng + 在凝胶基质中与蛋白交联 + 自动催化反应 - 染凝胶表面蛋白 - 线性化程度比考染低 -一些大分子物质也被染色 - 步骤多，某些步骤时间控制严格 55 / GE Title or job number / 2/20/2021 Silver stained gel of E. coli Lysate IPG 4-7 Silver stained with PlusOneKit without glutaraldehyde and f

34、ormaldehyde in the Ag sol. 56 / GE Title or job number / 2/20/2021 2D/MS 经典工作流程 差异分析 蛋白标记 挖点 酶解 点靶 蛋白鉴定 体液 植物 微生物 组织 细胞 分离 细胞裂解 匀浆 预分级 除杂质 浓缩 定量 样品制备 双向电泳 第一向 第二向 图像获取 图谱分析 银染 考染 荧光 染色 图谱分析 57 / GE Title or job number / 2/20/2021 ImageScanner III图像扫描系统 灰度校正功能 平台具有防水功能 ，可直接扫描 SDS- PAGE湿胶。 3.7OD高动态范围，

35、保证高、低丰度蛋白 的准确定量。 扫描平台大， A3扫描面积 ， 一次可扫描 2 块 24cm凝胶。 Gray 256 scale Transmissive 300dpi 58 / GE Title or job number / 2/20/2021 由 SIB, GeneBio和 GE Healthcare合作开 发，为 SwissProt推荐分析软件。 高效能参数自动找点，全自动蛋白定量计 算方法，不受背景影响。 在原始数据上进行分析，结果可靠。界面 窗口可随意设计，界面极其友好。 全自动凝胶匹配，采用先进的算法。根据 点的相关因素、形状、位置、周围情况， 胶间匹配效率高。 多种统计学分析

36、工具，快速找到胶间蛋白 表达差异。 可直接链接到 ExPASy 和 SwissProt 数据库，进行网上检索。 全部操作过程都可以撤销 /重作操作，每 一步骤都附有说明，使用方便。 全面支持 DIGE技术，源自 DeCyder 2D软 件。 ImageMaster 2D双向电泳分析软件 ImageMaster Platinum 7.0 软件分析流程 60 / GE Title or job number / 2/20/2021 2D/MS 经典工作流程 差异分析 蛋白标记 蛋白鉴定 体液 植物 微生物 组织 细胞 分离 细胞裂解 匀浆 预分级 除杂质 浓缩 定量 样品制备 双向电泳 第一向 第

37、二向 图像获取 图谱分析 银染 考染 荧光 染色 挖胶 图谱分析 61 / GE Title or job number / 2/20/2021 62 / GE Title or job number / 2/20/2021 自动斑点切取 Spot picker 切点针头 胶盘 MALDI-ToF 质谱分析 标记荧光 全自动 软件分析 自动切点 图像采集 双向电泳分离 自动酶解 蛋白质组学完整平台 样品制备 蛋 白 纯 化 蛋白质组学完整平台 64 / GE Title or job number / 2/20/2021 经典 2D 工作流 : 产品范围 Grinding kit 2-D Cl

38、ean-Up kit Mini dialysis kits 2-D Quant kit 2-D Fractionation kit Albumin & IgG removal kit Ettan IPGphor Immobiline DryStrip Ettan DALT twelve Ettan DALTsix DALT gel 12.5 ImageMaster DeCyder 2D 蛋白标记 样品制备 分离 染色 图谱分析 挖点 酶解 点靶 体液 植物 微生物 组织 细胞 Ettan Spot Picker Ettan Digester Ettan Spotter Ettan Spot Handling Workstation Deep Purple Total Protein Stain PlusOne Silver Staining Kit, protein CyDye DIGE Fluors 65 / GE Title or job number / 2/20/2021 Thank you! Any Questions.