分子生物学的基本竟能和策略

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1、 周 俊 宜 生化技术 电泳 层析 离心 分光光度 基因操作 其它 基因工程 分 切 接 转 筛 表 电泳 层析 离心 分光光度 基因操作 其它 分（离目的基因） 切（割目的基因和载体） 接（连目的基因和载体） 转（化宿主细胞） 筛（选阳性克隆） 表（达目的基因） 基 本 模 式 “ 纵 向 ” 体 系 “横向”体系 1 理论部分 基因工程原理 生化技术原理 新技术讲座 2 实验部分 分子生物学实验 生化技术实验 3 示教和录 像部分 实验原理 实验技术 基因重组 ： 不同的 DNA分子间发生共 价连接形成重组 DNA 分子。 重组 DNA 质粒 DNA 基因片段 1972年 ,P.Berg:

2、 构建第一个 DNA重组分子 1997年 ,动物克隆 : 克隆羊多莉 1977年，基因工程产品的出现 H.W.Boyer,第一个基因工程产品 (SS) 1973年 ,S.S.Cohen:第一个基因克隆实验 2001年，人类基因组计划 EcoRI Boyer 和 Cohen的实验 和 pSC101 pR6-5 大肠杆菌 pSC101 抗四环素 pR6-5 抗卡那霉素 DNA连接酶 重组 DNA分子 EcoRI 抗卡那霉 素基因 培养平皿 卡那霉素基因 四环素 卡那霉素基因 大肠杆菌 四环素平板 抗四环素 抗卡那霉素 抗四环素 抗卡那霉素 人体生长激素释放激素 (SS) 抑制和调节多 种激素的作用

3、 从动物脑中提取 : 5mg-50万只羊脑 基因工程 9升大肠杆菌 培养液 大肠杆菌 SS蛋白 重组体 + SS基因 大肠杆菌 SS蛋白 重组体 + SS基因 目的基因 基因载体 目的基因 基因载体 重组体 分 切 接 转 筛 表 总 体 技 术 路 线 目的基因及载体的分离 1 目的基因的获取 需要克隆的 DNA片段： 化学合成法 cDNA文库 基因组 DNA文库 聚合酶链式反应 分 分分 1）化学合成法： 较短的基因（ 60-80bp） 用途： PCR引物 测序引物 定点突变 核酸杂交探针 2）基因文库 限制性 内切酶 克隆、转化、培养、鉴定 基因组 DNA 基因文库 基因组 DNA文库

4、限制性内切酶 基因组 DNA 基因重组 转化细菌 体外包装 cDNA文库的组建 ： 基因重组 反转录酶 mRNA cDNA 引物 引物 3 5 5 5 3） PCR技术 基因组 PCR技术的基本过程 模板 DNA dNTP 引物 Buffer 预变性 模板 DNA dNTP 引物 Buffer TaqDNA聚合酶 循 环 仪 94oC5 94 55 72 2 载体 DNA的选择 功能： 为目的基因提供进入受体细胞的转移能力。 为目的基因提供在受体细胞中的复制能力 或整合能力。 为目的基因提供在受体细胞中的扩增和表 达能力。 目的基因 整合在宿主细胞 染色体 DNA中 独立于宿主细胞 染色体 D

5、NA外 （ 独立的复制子功能 ） 基因载体 理想载体的基本条件： 可转移性 合适的复制位点 多克隆位点：广泛、特异 选择标志，便于筛选和鉴定 分子较小，可容纳较大的外源 DNA 质粒 噬菌体 腺病毒载体 逆转录病毒载体 种类： 存在于细菌染色体外的小型环状 DNA分子。 具有 自我复制 功能。 带有抗性基因及表型识别等 遗传性标记物 。 经改造后具有 多克隆位点 。 举例： pBR322质粒 质粒 宿主细胞 ori 抗 Amp 宿主细菌 含 Amp培养基 多种酶切口 多克隆位点 限制性内切酶 单一酶切口 多克隆位点 ori 复制起始点 遗传标记 Amp polylinker 基因载体 噬菌体载

6、体 50kb + LA RA LA RA EcoR EcoR lacZ cI 限制性内切 酶酶切 切 酶切 限制性内切核酸酶 在特异位点上切割 DNA分子 分三类，常用为 类酶 识别序列呈回文对称 命名：酶来源的生物名称缩写 属名 -种名 -株名 -发现次序 5- GAATTC-3 3- CTTAAG -5 5- GTTAAC-3 3- CAATTG -5 EcoR 的识别序列 Hae 的识别序列 5NNNNNNNGAATTCNNNNNNNN3 3NNNNNNNCTTAAGNNNNNNNN5 5NNNNNG 3NNNNNCTTAAp EcoR 的识别序列和酶切切口（粘端） pAATTCNNNN

7、NN3 GNNNNNN5 5NNNNNNGTTAACNNNNN3 3NNNNNNCAATTGNNNNN5 5NNNNNGTT pAACNNNNN3 3NNNNNCAAp TTGNNNNN5 Hae 的识别序列和酶切切口（平端） 磷酸二酯键的形成 DNA连接酶 DNA连接酶 DNA连接酶 目的基因与载体的连接 接 T4-DNA连接酶 ： T4-噬菌体 连接温度： 不高于粘性末端熔点温度（ Tm） 15 ： 15/6h ； 12/8h ； 8/12h ； 连接方式： 相同粘性末端的连接 平头末端的连接 不同粘性末端的连接 人工粘性末端的连接 粘端连接 CCGG CCGG GGCC GGCC CGG

8、 C C GGC CGG C C GGC CCGG GGCC Hap T4-DNA 连接酶 平端连接 AGCT TCGA Alu DNA连接酶 AGCT AGCT TCGA TCGA 重组体的转化 受体细胞 转 JM109感受态 含氨苄平板 Am 重组 质粒 感受态 原核细胞的转化（细菌转化） 1)受体细胞的选择 限制缺陷型 : 避免修饰和降解 重组缺陷型： 避免重组整合 转化亲和型： 较高的可转化性 遗传互补型： 利于筛选 感染缺陷型： 防止感染 2）转化方法 CaCl2诱导转化 电穿孔 PEG介导转化 人工体外包装 特殊处理 受体细胞 细胞膜特性 改变 CaCl2处理 受体细菌 50-10

9、0mmol/L CaCl2 感受态 细菌 重组体转 入细菌 基因重组 转染 体外包装 噬菌体 噬菌体体外包装 3）转化率 ： 转化细胞 /细胞总数 影响因素： 载体： 载体性质、空间结构、分子大小等 受体细胞 转化过程 含氨苄平板 连接 目的基因 基因载体 连接酶 转化 重组体克隆的筛选与鉴定 筛 宿主细胞 转化后的克隆群体： 1遗传检测法 1）抗药性标志的选择 pBR322 Amp Tet 插入片段 Amp平板 Tet平板 2）标志补救（ -半乳糖苷酶法） lacZ Am N2H 片段 COOH 片段 X-gal Lac Z 蓝色化合物 X-gal （ LacZ基因 N端序列） 插入片段 （

10、 LacZ基因失活） LacZ基因 N端序列 LacZ酶 2 电泳检测法 凝胶电泳检测 加 样 孔 DNA Marker 空质粒 重组质粒 重组质粒酶切 重组质粒的 PCR 扩增片段 原位杂交 3 菌落杂交筛选法 4 免疫化学检测法 放射性抗体检测法 滤膜（固定抗体） + 5 DNA序列检测 A C T G A A G G C T 外源基因在宿主细胞中的表达 重组子 目的基因 的 mRNA 表达蛋白质 大肠杆菌（ E.coli） 受体细胞 表 1 E.coli表达体系 优势： 一种成熟的基因克隆表达的受体细胞 繁殖迅速，培养代谢易于控制 易于进行遗传操作和高效表达 不足之处： 1）缺乏适当的转

11、录后和翻译后加工机制。 2）缺乏表达蛋白质复性系统，表达蛋白无特 异性空间结构。 3）表达产物不稳定，易被细菌蛋白酶降解。 2目的基因在 E.coli中的高效表达 三个因素： 强化蛋白质的生物合成 抑制蛋白质的降解 恢复蛋白质的空间构象 3目的基因表达产物的检测 1）蛋白质的 PAGE 对照 样品 Marker 2）表达蛋白生物学功能检测 淀粉酶基因表达 4目的蛋白的分离纯化 分子筛 亲和柱 离子交换 抗原抗体 目的蛋白 基因载体 目的基因 质粒 噬菌体 病毒 PCR cDNA 人工合成 基因文库 限制性内切酶 有切口的载体 有切口的目的基因 DNA连接酶 重组体 转化 转染 体外包装 带重组体的宿主细胞 表型筛选 电泳法 核酸杂交 免疫学方法 目的基因的表达 Amp p ori 多克隆位点 温度敏 感型 基因载体 ori 举例 阻遏蛋白 基因 宿主细胞 ori 目的基因 PL 阻遏 蛋白 28 下培养： （ 60拷贝 /细胞） 目的基因 阻遏 蛋白 42 下培养： 失活 （ 700拷贝 /细胞）