双歧杆菌分离培养鉴定

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1、1 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：2.1 恒温培养箱：36 C1 C。2.2 气相色谱仪配 FID 检测器。2.3冰箱：2 C5 C。2.4 天平： 感量 0.1 g。2.5 无菌试管：18 mm X 180 mm、15 mm X 100 mm。2.6无菌吸管：1 mL (具0.01 mL刻度)、10 mL (具0.1 mL刻度)或微量移 液器(200 口 L1000 口 L)及配套吸头。2.7 无菌锥形瓶： 500 mL、 250 mL。2.8 显微镜2 培养基和试剂3.1 BS 培养基3.2 PYG 培养基3.3 TPY 培养基3.4 NPNL 培养基

2、3.5 X-GAL 培养基3.6 氟化钠：化学纯。3.7 碘乙酸钠或碘乙酸钾：化学纯。3.8 果糖-6-磷酸盐：化学纯。3.9 盐酸羟胺(Hydroxy Lamine-HCl)：化学纯。3.10 三氯乙酸(TCA):化学纯。3.11 三氯化铁(FeC136H2O)：化学纯。3.12 甲醇:分析纯。3.13 三氯甲烷：分析纯。3.14 硫酸：分析纯。3.15 冰乙酸：分析纯。3.16 乳酸：分析纯。3.17乙酸标准溶液：吸取分析纯冰乙酸5.7mL,移入100mL容量瓶中,加水至刻度, 标定，标定方法见附录B.1，此溶液浓度约为1mol/L。3.18乙酸标准使用液:将经标定的乙酸标准溶液用水稀释至

3、0.01mol/L。3.19乳酸标准溶液：吸取分析纯乳酸8.4mL，移入100mL容量瓶中,加水至刻度， 标定，标定方法见附录B.2,此溶液浓度约为1mol/L。3.20乳酸标准使用液：将经标定的乳酸标准溶液用水稀释至0.01mol/L。3双歧杆菌的分离和培养在无菌室内无菌称取lg双歧杆菌制剂，根据标示的活菌数量，用灭菌稀释液进 行10倍梯度稀释至104-107，然后吸取0.2mL涂布于BS和NPNL琼脂平板上，放 于厌氧培养箱内培养48到72小时.然后挑选菌落特征为光华、凸圆、边缘整齐、 白色或乳脂色、质地柔软的中小菌落，接种于TPY琼脂平板上厌氧培养。待长出 菌落后，每个平板选5个以上的特

4、征菌落，先进行革兰氏染色，挑选具有双歧杆 菌形态等特征的菌落，再进行需氧和厌氧培养，剔除需氧和厌氧都生长的菌落， 选取仅厌氧培养生长的菌落，进一步在TPY琼脂平板上纯化菌株直至镜检为纯菌 株。分纯后的菌株进行革兰氏染色，显微镜下观察其形态，然后进行鉴定，经鉴 定是双歧杆菌的菌株在TPY液体培养基中增菌至平稳期，4C, 6000gX15min条件下离心收集菌体分散于20%灭菌脱脂中，然后在一 30 40C条件下冻干，冻 干完成后，在真空条件下压盖，T8C贮存。 3-1从双歧杆葡制捌中分离瑕歧朴菌4厌氧培养法液体中的厌氧培养采用亨盖特厌氧培养技术(Min,1999;Chung,1997)。将配置

5、好的培养基中加入0.01%亚甲基蓝作为氧指示剂，然后将其加热至沸腾，同时通 入高纯氮气，5分钟后迅速将加热的培养基放入冷水中冷却至45C，亚甲基蓝显 示为无色则表示已经达到厌氧，迅速盖上橡胶塞，以上操作过程中均保持高纯氮 气的不断通入。然后将培养基置于121C，灭菌21分钟。5双歧杆菌的鉴定(1) 镜检(2) 在基础改良MRS培养基中添加X- Gal,对双歧杆菌进行检测双歧杆菌单独表面涂布呈白色或浅兰色，标准双歧杆菌表面涂布37 C48 h培养 后，双歧杆菌呈白色或浅兰色，边缘整齐,表面隆起部分显白色，菌落背面观察呈 兰色底晕，随机挑取5个白色菌落经革兰氏染色涂片镜检，该菌为革兰氏阳性, 呈各

6、种分叉, V 形, 棍棒状, 单个, 成对, 或链状排列, 多种不规则形状, 即可基 本判定为双歧杆菌。6形态特征菌株在TPY固体平板上厌氧培养24小时，然后进行革兰氏染色，对其个体形态 特征进行显微观察。同时把菌株接种平板上培养48小时，进行菌落形态观察。 通过菌落及菌体形态可以看出：双歧杆菌菌落微小，光滑，乳白色，呈水样半透 明或不透明，边缘整齐，凸起。菌体革兰氏染色呈阳性，并呈多形态性，菌体不 规则，传代后，“V”字形和“Y”字形较少见。7生理生化检验糖发酵试验:在无菌操净台内将双歧杆菌合适稀释度的稀释液20mL接种到各糖 发酵管中，37C48h厌氧培养。触酶试验:挑取固体培养基18-2

7、4h内的菌落1接种环，置于洁净玻片上，滴加 3%过氧化氢溶液数滴（新鲜配制），观察结果。明胶液化试验:在无菌操净台内将待测菌株接种到装有明胶培养基的厌氧管中， 放入37C恒温培养箱中培养5-7天，然后置于4C30分钟。同时准备两只未接 种的厌氧管进行对照。吲哚试验:将菌液置于37C恒温箱中培养4无然后在菌液中加入吲哚试剂lmL。 阳性:培养物与试剂接触处产生一红色的环状物。阴性:培养物仍为黄色。硝酸盐还原试验:在无菌操净台内将待测菌株接种于硝酸盐还原培养基中，置于 37C恒温箱中厌氧培养，分别在3d，5d时进行检测。检测时取培养液约0.smL 于干净的试管中，先后滴入格里斯氏试剂A液、B液各2

8、滴，如无红色出现，则 加1-2滴二苯胺试剂，若出现蓝色，此菌株进行下一步检测。同时对培养液进行 镜检，菌生长良好，且空白对照管加入格里斯氏试剂无红色出现时，以上检测结 果有效。淀粉试验:在无菌操净台内将双歧杆菌合适稀释度的稀释液100UL接种到淀粉固 体培养基上，用L棒涂布均匀，37C48h倒置厌氧培养。附：糖发酵培养基:将PY基础培养基中加入1%的各种糖，再加溴甲酚紫一滴，115C 高压灭菌。触酶试剂:3%过氧化氢溶液（现用现配）。明胶试剂:将15%的明胶加入PY培养基中，115C高压灭菌。 吲哚试剂:对二甲基氨基苯甲醛 1g95%酒精 95mL浓盐酸50mL硝酸盐试剂:PYG培养基内加入1

9、%。硝酸钾。格里斯氏试剂:A液:对氨基苯磺酸0.5g，10%稀醋酸150mLB液：a-萘酚0.1g，蒸馏水20mL，10%稀醋酸15OmL二苯胺试剂:对苯胺0.5g溶于IOOmL浓硫酸中，用20mL蒸馏水稀释 淀粉试剂:在PY基础培养基中加入2%，115C高压灭菌。双歧杆菌的分离培养鉴定方法流程操作步骤5.1 样品制备5.1.1样品的全部制备过程均应遵循无菌操作程序。5.1.2以无菌操作称取25g （或mL）样品，置于装有225 mL生理盐水的灭菌 锥形瓶内，制成1:10的样品匀液。5.2稀释步骤5.2.1用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1.0 mL,沿管壁缓慢 注于装有 9m

10、L 生理盐水的无菌试管中（注意吸管尖端不要触及稀释液），振摇 试管或换用 1 支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成 1:100 的样品匀液。5.2.2 另取 1mL 无菌吸管或微量移液器吸头，按上述操作顺序，做 10 倍递增 样品匀液，每递增稀释一次，即换用 1 次 1mL 灭菌吸管或吸头。5.3 纯培养挑取3个或以上的菌落接种于BBL琼脂平板，厌氧，36C1C培养48h。5.3.1 镜检及生化鉴定：5.3.1.1 涂片镜检：双歧杆菌菌体为革兰氏染色阳性，不抗酸、无芽孢，无动力， 菌体形态多样，短杆状、纤细杆状或球形，可形成各种分支或分叉形态。5.3.1.2 生化鉴定：选取纯培养平板上的三个单

11、个菌落，分别进行生化反应检测， 不同双歧杆菌菌种主要生化反应见表1 。5.4果糖-6-磷酸盐磷酸酮酶（F6PPK）的测定，见附录B。5.5 气相色谱法测定双歧杆菌的有机酸代谢产物, 见附录 B挥发性乙酸的测定:纯培养物2mL加50%硫酸0.10.2mL酸化-连续倒置混匀100 次加ImL乙醚充分振摇5-10min离心5min取上层0.5.mL至另一有少许无水 氯化钙的干净试管中取2pL进行气相色谱分析。非挥发性乳酸的测定:纯培养物 2mL 加 50%硫酸 0.1 一 O.2mL 酸化加 lmL 甲醇 溶液60C水浴1小时加0.5mL氯仿离心5min取出试管用毛细吸管吸取底层 0.2-0.4UL

12、至另一有少许无水氯化钙的干净试管中取2pL进行气相色谱分析。6 报告根据5.3项镜检及生化反应结果、5.4项果糖-6-磷酸盐磷酸酮酶（F6PPK） 阳性结果和 5.5 项双歧杆菌的有机酸代谢产物乙酸与乳酸微摩尔之比大于 1A1 BS培养基A.1.1成分用量酵母粉6.0 g胰酶水解酪蛋白5.0 g植物蛋白胨3.0 g多胨3.0 g葡萄糖10.0 g可溶性淀粉0.5 g蛋白胨7.0 g西红柿浸出液200.0 mL吐温801.0 mL肝浸液150mL琼脂20.0 g溶液A10mL溶液B5mL蒸馏水800mLL-半胱氨酸盐酸0.5 gBS添加液50mLA.1.2 制法A.1.2.1半胱氨酸盐溶液的配置

13、：称取半胱氨酸0.5 g,加入1.0 mL盐酸，使半胱氨酸全 部溶解，配制成半胱氨酸盐溶液。A.1.2.2西红柿浸出液的制备：将新鲜的西红柿洗净后称重切碎，加等量的蒸馏水在100C 水浴中加热，搅拌90min,然后用纱布过滤，校正pH7.0,将浸出液分装后，121C高压灭 菌 15 min20 min。A.1.2.3制法：(1)除BS添加液外，其他成分加热溶解，调pH至7.2，115.6C高压灭菌 20min，冷至50C时加BS添加液，混匀倾注平皿。(2)BS添加液:丙酸钠30g加入灭菌烧瓶中，加灭菌蒸馏水80mL，待溶解后加硫酸新霉素 400mg，巴龙霉素100mg, LiCl 6g,再加灭

14、菌蒸馏水至100mL, 4C保存。溶液 A: KHPO 25g KHPO 25g 水 250g2424溶液 B： MgSO 7HO 10g FeSO 7HO 0.5g NaC1 0.5g MnSO 0.337g 水 250g42424NPNL培养基琼脂15g葡萄糖10g牛肉提取物3g肝浸液150ml植物蛋白胨3g蛋白胨10g溶液A 10ml 溶液B 5ml 吐温-80 1g胰蛋白酶5g酵母提取物5g可溶性淀粉0.5gNPNL溶液10ml L-半胱氨酸盐酸0.5g去离子水815ml1 溶液A,溶液B同上2 NPNL溶液LiCl 3g奈啶酮酸15g硫霉素100mg硫入龙霉素200mg水1000mA

15、.2 PYG液体培养基A21成分用量蛋白胨10.0 g葡萄糖2.5 g酵母粉5.0 g半胱氨酸-HC10.25 g盐溶液20.0 mL维生素K1溶液0.5 mL氯化血红素溶液2.5 mL加蒸馏水至 500.0 mLA.2.2 制法A.2.2.1盐溶液的配制：称取无水氯化钙0.2 g，硫酸镁0.2 g，磷酸氢二钾1.0 g，磷酸二氢 钾1.0 g,碳酸氢钠10.0 g,氯化钠2.0 g,加蒸馏水至1000 mL。A.2.2.2氯化血红素溶液（5mg/mL）的配制：称取氯化血红素0.5 g溶于1mol/L氢氧化钠 1.0 mL中，加蒸馏水至1000mL, 121 C高压灭菌15 min20 min

16、。A.2.2.3维生素K1溶液的配制：称取维生素K11.0 g,加无水乙醇99 mL,过滤除菌，冷藏 保存。A.2.2.4制法：除氯化血红素溶液和维生素K1溶液外，A.2.1其余成分加入蒸馏水中，加热 溶解,校正pH6.0,加入中性红溶液。分装后121C高压灭菌15 min20 min。临用时加热熔化琼脂， 加入氯化血红素溶液和维生素K1溶液，冷至50C使用。A.3 TPY液体培养基A.3.1成分用量水解酪蛋白10.0 g植物胨5.0 g酵母粉2.0 g葡萄糖5.0 g磷酸氢二钾（K2HPO4 7H2O）2.0 g氯化镁(MgCl26H2O)0.5 g硫酸锌(ZnSO47H2O)0.25 g氯

17、化钙（CaCl2）0.15 g氯化铁（FeC13）0.1 mg叶温-801.0 mL蒸馏水至 1 000.0 mLA.3.2制法：A.3.2.1半胱氨酸盐溶液的配置：称取半胱氨酸0.5 g,加入1.0 mL盐酸， 使半胱氨酸全部溶解，配制成半胱氨酸盐溶液。A.3.2 .2制法：将A.3.1成分加热溶解，然后加入半胱氨酸盐溶液，校正pH6.50.1,分装 后121C高压灭菌15mi n20 min号项目幽歧应坟杆雷星儿戍歧杆雷 述.讪伽旳、(B. fcjrglfffl J走物或坟杆呆(B短刈歧杆曲(B.brei-e)I甘油234阿拉怕稱4LWft怕諂*屯礴丰丰6D木儀+d+71-水箱E阿东璋9医

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20、-HCl） 139mg/mL水溶液，使用时以NaOH中和至pH6.5。（5）15g/100mL三氯乙酸（TCA） 水溶液。（6）4mol/L HC1。（7）0.5 g/100mL FeCl3 6H2O 溶于 0.1mol/L HCl 中。B.1.2检测步骤挑取BBL琼脂平板上纯培养的双歧杆菌接种到TPY液体培养基，厌氧，36C1C培养 72h 3h。从10mL TPY培养液于3000r/min离心5min,弃上清液，细胞用上述试剂Q）洗涤2 次，然后悬浮于l.OmL试剂（1）中。将盛有细胞悬液的容器置于一冰浴内，用超声波处理 20min,以破碎细胞。然后在超声波处理物中加入试剂（2）和试剂（3

21、）各0.25mL,置于37C 保温30 min。保温后在溶液中入1.5mL试剂（4）,置室温5 min。加入试剂（5）和试剂（6）各1mL,置室温5 min。然后加入1mL试剂（7）观察溶液颜色B.1.3 结果判定：经以上程序测定如显红褐色或红紫色，则果糖-6-磷酸盐磷酸酮酶为阳 性，否则为阴性。B.2 气相色谱法测定双歧杆菌的有机酸代谢产物B.2.1 双歧杆菌培养液制备挑取 BBL 琼脂平板上纯培养的双歧杆菌接种于 PYG 液体培养基，同时用未接种菌的 PYG液体培养基做空白对照，厌氧，36C1C培养48h。B.2.2 标准液的配制B.2.2.1乙酸标准溶液：准确吸取乙酸5.70mL加水稀释

22、至100.0mL，摇匀，进行标 定，配成约1.0 mol/L的乙酸标准溶液。标定方法为：准确称取乙酸3 g，加水15 mL,酚 酞指示液 2 滴，用 1 mol/mL 氢氧化钠溶液滴定，并将滴定结果用空白试验校正。 1mL 1 mol/mL 氢氧化钠溶液相当于 60.05mg 的乙酸。B.2.2.2 乙酸使用液：将经标定的乙酸标准溶液用水稀释至 20.0 mmol/L。B.2.2.3乳酸标准溶液:准确吸取含量为85%90%的乳酸0.84 mL,加水稀释至100.0mL, 摇匀，配成1.0 mol/L的乳酸标准溶液。标定方法为：准确称取乳酸1 g,加水50 mL,加入 1 mol/mL氢氧化钠滴

23、定液25 mL,煮沸5min,加入酚酞指示液2滴，同时用0.5 mol/mL用 1 mol/mL硫酸滴定液滴定，并将滴定结果用空白试验校正。1mL 1 mol/mL氢氧化钠溶液相 当于 90.08mg 的乳酸。B.2.2.4 乳酸使用液：将乳酸标准溶液用水稀释至20.0 mmol/L。并有机相，于40C水浴中用氮气吹至少量溶液存在，用丙酮定容至1.0 mL，混匀后备 用。同样操作步骤处理乙酸标准和空白培养液。B.2.3 方法B.2.3.1 乙酸的处理取双歧杆菌培养液2.0mL3.0mL放入10mL离心管中，加入0.2mL 50%（v/v）硫酸溶 液，混匀，加入2.0mL丙酮，混匀后加过量氯化钠

24、，剧烈振摇1min,再加入2.0mL乙醚， 振摇1min后，于3000r / min离心5min,将上清液转入另一试管中，下层溶液用2.0mL 丙酮和2.0mL乙醚重复提取2次，合并有机相，于40C水浴中用氮气吹至少量溶液存在， 用丙酮定容至1.0 mL,混匀后备用。同样操作步骤处理乙酸标准和空白培养液。B.2.3.2 乳酸的处理取双歧杆菌培养液2.0mL3.0mL放入10mL比色管中，100C水浴10min,加入0.2mL 50% （v/v）硫酸溶液，混匀，加入1.0mL甲醇，于58C水浴30min后加水1.0mL，加三 氯甲烷1.0mL，振摇3min, 3000r/min离心5min,取三

25、氯甲烷层分析。同样操作步骤处理 乳酸标准和空白培养液B.2.3.3气相色谱条件色谱柱:长2m,内径4mm的玻璃柱，填装涂有20%DNP +7%Tween60的chromosorbw HP （80100 目）；柱温：110C；汽化室：150C；检测器：150C；载气：（N2） 50ml/min；进样量1.0卩1；外标法峰面积定量。乳釀标弁乙酸标准B.2.4结果计算:X样品培养液中乙酸或乳酸的含量，单位为微摩尔每毫升（mol/mL）；A样一一样品培养液中乙酸或乳酸的峰面积；A空空白培养液中乙酸或乳酸的峰面积；A标一一乙酸标准或乳酸标准的峰面积；C乙酸标准或乳酸标准的浓度，单位为微摩尔每毫升（mol/mL）。B.2.5允许差：相对相差W15%。B.2.6结果判定：如果乙酸（mol/mL）与乳酸（mol/mL ）比值大于1,可判定为是双歧 杆菌的有机酸代谢产物。