7.造血干细胞表型及分离纯化方法

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1、造血干细胞表型及分离纯化方法 1 一个多世纪前，由 Arturappenheim(18701916)提出。是一类同时具有自我更新和向各系血细胞分化能力的原始细胞群。HematopoieticStemCell2支持干细胞存在的初始证据支持干细胞存在的初始证据1.从小鼠独特的染色体标记中证实，存在能同时产生淋巴和髓系细胞的 多能干细胞(pluripotent)。2.慢性髓性白血病同工酶分析可见，B淋巴细胞和髓样细胞都来自慢性 髓性白血病干细胞克隆。33.用带有新霉素抗性基因标志的逆转 录病毒载体转染鼠骨髓细胞，分析 病毒特异聚集部位证实，不同淋巴 和髓系表型的细胞来自同一干细 胞。4.鼠胎肝造血祖

2、细胞体外单细胞培养 可生成髓系和粒系细胞。4 缺乏辨认、计数干细胞的手段。干细胞的辨认仅靠体外克隆形成分析和估算如：CFU-GM，CFU-Mix。Civin等制备出一株鼠抗人髓系白血病细胞单抗(My-10),当时称KG-la,该抗体可与所有造血前体细胞(progenitors)特异结合。过去干细胞研究进展缓慢的原因过去干细胞研究进展缓慢的原因5 之后，其他研究小组也相继研制出12.8;BI-3c5;ICH-3等类似抗体。1986年，这些抗体被命名为CD34，为目前公认的干细胞的重要标志。CD34抗原的发现促进了造血干细胞研究的深入和发展，是一重要的里程碑事件。6一.造血细胞的表型 CD34；S

3、ca-1；Thy-1；Lin-；c-kit 二.造血细胞分离方法 FACS；磁柱分离；亲合分离；Panning本次课的主要内容本次课的主要内容7一、造血干细胞表型 免疫技术、克隆技术、流式细胞分类术等的发展，促进了干细胞的研究，相继发现许多干细胞特有的表型(phenotype)。如 CD34；Sca-1；Thy-1；Lin；c-kit 等。81.1.CD34的生物学特性的生物学特性（一）（一）CD34 基因定位基因定位 Chromosome1,(1q32)(human)也有报道位于1q12qter与CD45及一些其它膜蛋白家族毗邻。9全长(spans)2628kb(human),编码序列含8个

4、exons，第1和8个exon编码翻译区和部分非翻译区；27个exons仅编码翻译区。也有报道人CD34基因全长38kb。基因长度基因长度10 在 cytoplasmicdomains,人、鼠CD34基因的同源性达90%以上。这种同源性在N末端逐渐减少为45%左右。人、鼠人、鼠CD34基因的同源性基因的同源性11分子量为105-120kd。人CD34cDNA转录翻译的多肽链长373个氨基酸残基，是一跨膜蛋白。CD34分子的大小分子的大小12 N端为20aa的信号肽，含有大量的serine/threonine；胞外区258aa；跨膜区22aa；胞内区73aa。不同部位不同部位AAAA的长度为：的

5、长度为：13所谓表位是指同一抗原分子上有不同的抗原识别位点。目前有My-10,BI-3c5,12.8,ICH-3,TUK,115.2等单抗识别的位点。前四株识别的表位取决于sialicacidresidues,后二者却不一样。CD34分子的分子的epitopes14 （根据对neuraminidase和glycopotease的敏感性不同）对GPAs敏感，对NAAs敏感性不同(My-10,BI-3c5,12.8,ICH-3)对GPAs，NAAs都敏感(TUK3,115.2,8G12)对NAAs不敏感，对GPAs敏感(QBEND-10)CD34表位分表位分三类三类：15 许多CD分子既是细胞分化

6、的标志也是功能的标志。CD34分子的确切功能目前尚不完全清楚，但已发现具有以下功能：2.2.CD34的功能的功能16(1)(1)粘附功能粘附功能(与与stromal cell 粘附粘附)电镜发现CD34分子浓集在内皮交叉膜(interdigitatingmembrane)的micro-processes。此部位是白细胞结合并迁移到血管外的重要部位。CD34分子的结构可能影响其与细胞的粘附。17 此外，淋巴内皮小静脉粘附实验表明，由重组L-selectin识别的一种内皮糖蛋白的硫化碳水化合物，其氨基酸的序列与CD34一致，因此，CD34分子至少可作为L-selectin的配体，协助干细胞与基质细

7、胞接触和粘附。18 干细胞越原始，表面CD34分子密度越大，细胞分化到形态学发生改变时，表面CD34分子表达逐渐减少，直至消失。推测，在造血早期，CD34分子的作用可能与干细胞之间或干细胞与基质细胞之间的接触、通信和相互作用有关。(2)(2)细胞间接触、通信和相互作用细胞间接触、通信和相互作用19 Civin小组证实，CD34可由激活的PKC迅速磷酸化，激活的PKC能刺激CD34阳性前体细胞CD34上调，这种上调独立于内质网内CD34的转录和转换。可见，CD34磷酸化是细胞表面上调的扳机，PKC活化是生长因子配体-受体结合启动胞浆信号转导级联的一个成分。(3)(3)在细胞信号传导中的作用在细胞

8、信号传导中的作用20 外周血单核细胞约为0.1%破骨细胞(osteoclasts)、骨髓基质前体 细胞、外周神经鞘细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞等也发现有CD34抗原表 达。骨髓单核细胞约为13%。3.3.细胞细胞CD34的表达的表达21一些恶性疾病，如AML、早前，前和急性T淋巴细胞白血病细胞都有CD34抗原的表达。在成人AML中，外周细胞CD34的表达预示患者对系统治疗反应较差，完全缓解率及存活率低，传统的化疗方案治疗效果可能不好。22根据细胞表面抗原表达的情况，可将CD34阳性细胞分为许多亚群，这些细胞多数已定向到特定细胞系。与CD34共表达，可作为干细胞进一步分型依据的抗原有：CD38

9、、CD10、CD19、CD5、CD7、CD71、CD45、CD41、CD13、CD33等。4.4.CD34阳性细胞亚群阳性细胞亚群23不同不同CD34阳性细胞亚群阳性细胞亚群CD34+CD38-；CD34+CD38+；CD34+CD10+CD19+(前B)；CD34+CD5+CD7+(前T)；CD34+CD71+CD45RO+(红前)；CD34+CD41+(巨前)；CD34+CD13+CD33+CD45RA+(髓前)24CD34hiLin-HLA-DRlowThy-1+CD45RO+Rhodull.较原始干细胞亚群的免疫表型一般为：(Rhodamine 123 Dull)25CD34+CD38

10、-HLA-DR+和CD34+CD38-HLA-DR-两群细胞，前者克隆率为50%，能向所有造血细胞系分化；后者除前者功能外，还能形成复杂的，能支持造血前体细胞分化的基质结构，这种细胞被命名为Common(hematopoietic/stromal)StemCell(CSC)。三色分析又发现三色分析又发现26 Osawa等人首先证明小鼠HSCs可以是 CD34阴性的。人的CD34阴性细胞也有低水平的造血能 力。移植研究表明胎绵羊CD34阴性细胞有重 新繁殖的能力。人和鼠的CD34阳性细胞可能来源于CD34阴性细胞。CD34是是HSCs标志物近年受到的挑战标志物近年受到的挑战27 这些报告提示，H

11、SCs可能是CD34+或CD34-。只选择表达CD34的细胞可能导致将更原始的干细胞排除在外。然而几乎所有的临床和实验流程包括体外培养、基因疗法和HSC抑制，目前都设计成收集富含CD34+的细胞。28(二二)干细胞其它免疫表型干细胞其它免疫表型29从前T细胞杂交瘤中得到的几株单抗，由此单抗识别的抗原被命名为Sca-1。是18kDa磷脂酰肌醇锚定蛋白，属Ly-6抗原家族成员。43Sca-1被广泛认为和Ly-6半抗原一起，是小鼠HSC标志分子，在多能HSCs上表达。1.Stem cell antigen-1(Sca-1)30 抗Sca-1抗体经常和一些细胞表面标志分子联用一起用来鉴定和分离小鼠HS

12、Cs。Sca-1+HSCs可在成年骨髓、胎儿肝脏、成年动物外周血和脾脏中被找到。Sca-1在几种非造血组织中也被发现。43Sca-1可用来富集HSCs之外的祖细胞。Sca-1可能参与调节B细胞和T细胞活化。31根据Sca-1是否阴性可将Thy-1lowLin-细胞进一步分为：Thy-1lowLin-Sca-1+和Thy-1lowLin-Sca-1-两群，前者含干细胞和CFU-T，后者不含CFU-T，两群细胞都含CFU-s。32mouse和rat骨髓造血干细胞中与淋巴系组细胞定向、分化有关的抗原。2.Thy-1(CD90)33一种原癌基因。最近证明造血干细胞与c-kit基因密切相关。c-kit可

13、编码一种穿膜酪氨酸激酶受体分子。应用单克隆抗体证明此分子可存在于造血干细胞膜上，其后证明它的配体分子是造血干细胞因子（stemcellfactor,SCF），一种信号传导分子，对造血干细胞的分化具有重要作用。3.c-kit(CD117)34 c-kit分子可高频率表达于多能干细胞表面,但骨髓中c-kit+细胞可分化为各种血细胞，而胸腺中c-kit细胞可分化为淋巴细胞，不能分化为髓系细胞，所以胸腺内c-kit+细胞，可能是淋巴样干细胞。35 Lineage negative,指指 T-、B-、M-、G-细胞。细胞。4.Lin-3697kDa的糖蛋白，包括5个跨膜结构域，糖基化后在蛋白胶上显示12

14、0kDa的蛋白带。最初是通过AC133单抗鉴定的，它能识别人HSCs的CD34+亚类29,30。一种CD133异构体AC133-2,最近已经被克隆并鉴定为可被AC133抗体识别的原始表面抗原。5.CD133(AC133)37 Chromosomal Location 4p16.2-p12 humanTheAC133antigenislikelytocontain5-TMdomainsinadditiontoasignalpeptide.The5-TMstructureincludesanextracellularN-terminus,twoshortintracellularloops,two

15、largeextracellularloopsandanintracellularC-terminus.Protein Sequence38hematopoieticstemandprogenitorcells.neuralandembryonicstemcells.someleukemiasandbraintumoursthatmaybederivedfromstemcells.Lowlevelexpressioncouldalsobedetectedinthekidney,pancreas,placenta,andfetalliver.Expression39FMACS-isolated

16、CD133+cells became adherent and CD133-during cultivation,but gave rise to non-adherent CD133+cells budding from the adherent cell surface by a symmetric cell division.Cells were stained with CD133/1(AC133)-PE.4041Tree of differentiation 426.ABCG2(ATP-bindingcassette,sub-familyG,member2)Synonyms:ABC1

17、5,ABCP,BCRP,BCRP1,BMDP,Breastcancerresistanceprotein,EST157481,MRX,MXR,MXR1,Placenta-specificATP-bindingcassettetransporter.43二、造血干细胞的分离纯化二、造血干细胞的分离纯化44 1.Fluorescence Activated Cell Sorting(FACS)45(1)(1)组成组成细胞计数数据收集结果处理光源液流46(2)(2)基本原理基本原理 Flowcell液体+cell液鞘单细胞液柱激光激发数据处理样本+气压4748定量分析定量分析4950(3)(3)非标

18、记分析非标记分析根据光散射特性，FACS利用前向光散射(FLS)区别细胞大小，利用垂直光散射(PerpendicularLightScatter)观察细胞的形态和结构。用上述方法分离细胞称非标记分离。51(4)(4)标记分离标记分离 利用被分离细胞表面的一些抗原或受体与相应配体结合，用激光激发结合配体上的萤光，分析不同标记物的光谱，对细胞进行分离。52532.2.avidin-biotin 亲合分离亲合分离 细胞用biotin化的抗CD34抗体标记avidin化的polycrylamidebead柱CD34阳性细胞挂在柱上机械振摇，冲洗柱床收获细胞54一根商品化的分离柱(CEPRATM)一次可

19、收获50 x109个CD34细胞，分离细胞CD34阳性率为67%,占整个分离细胞阳性率的51%。整个分离过程约需二小时。(94年前的产品)553.Megnetic Activated Cell Sorting上述方法花费大。之后发展了一种iron-dextran系统。细胞-dextran-iron，磁场吸附，去掉未吸附细胞，去掉磁场收获感兴趣的细胞。该法特异性较差，分离率不高。56聚苯乙烯包被的微球法：聚苯乙烯包被的微球法：细胞与抗CD34抗体孵育与二抗包被的微球孵育启动磁场到掉未结合细胞去掉磁场蛋白水解酶消化收获细胞57Magnetic labeling Magnetic separatio

20、n Elution of the non-Labeled cell fraction Elution of theLabeled cell fraction 58MiniMACS SeparatorBasic for the lab:Mini MACS Separator with MS Column.59autoMACS SeparatorAutomated bench-top magnetic cell sorter for high cell numbers or multiple samples 60CliniMACSplus InstrumentCliniMACS allows la

21、rge cell numbers to be separated in a closed and sterile system.61方法评价：方法评价：属间接法。分离细胞纯度达90%以上，回收率约为67%。由于去掉磁珠时使用了蛋白酶，对细胞其它表面分子有一定破坏作用，该法分离细胞表型完整性尚不十分清楚。62直接法：直接法：抗CD34、CD38等抗体吸附在直径不同的磁珠上，细胞与之孵育，开启磁场，表面抗原阳性的细胞被吸附，去掉未吸附细胞，去掉磁场，收获表型阳性细胞。63磁珠法简介磁珠法简介磁珠的结构特点：从里到外由金属颗粒(Fe2O3,F3O4)核心；外包高分子材料(聚苯、聚氯乙烯)；吸附功能分

22、子层(-NH2，-COOH，-OH)64 包被后的磁珠其大小、形状和均匀度要一致，以减少非特异性结合。磁珠应具有超顺磁性，以保证磁场撤销后，磁珠的磁力很快消失，细胞能脱离磁板或磁柱。65技术原理：技术原理：磁珠实际是一种抗原、抗体或其它分子的载体，通过与细胞上的蛋白或分子结合，在磁场的作用下使细胞或分子吸附或移动，达到分离细胞和分子的效果。66细胞从磁珠上解离的方法细胞从磁珠上解离的方法370C孵育过夜使细胞直接解离。通过某种生物、化学反应解离如Dynal公司的DTAcHaBEAD分离系统。该系统不改变细胞表面抗原表达，不损伤细胞活性，不残留抗体。67环磷酰氨、GSF动员PBMCPBMC+CD

23、34包被磁株(1:16)40C,30min加磁场吸附去上清举举 例例68磁柱(板)重悬于培养液中去掉磁场5%CO2,370C过夜弃磁珠收获CD34+细胞(纯度为5692%)69 磁珠抗体包被多分离效率高，但 抗体包被多分离的特异性下降。磁珠的几何尺寸、物理生物活性 要求高，因而产品价格较贵。磁珠与细胞的分离效果并不象厂 家说的那样既干净，又不影响细 胞活性。磁珠法的不足：磁珠法的不足：704 4、其它分离方法、其它分离方法F克隆法F选择法F离心法F淘金(Panning)法71Panning法原理法原理 Polystryrene(聚苯乙烯)板经处理后包被抗体；分离细胞与板孵育；去掉未结合细胞；机械振摇收获所需细胞。可重复多次。7273