玉米叶片叶绿素的提取和测定

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1、玉米叶片叶绿素的提取和测定摘要：利用80%的丙酮提取玉米叶片中的叶绿素，再利用分光光度计测定在 663nm和645nm特征波峰下的光密度值，进一步算出玉米叶绿素的含量。关键词：叶绿素；提取；含量测定Abstract: corn leaf chlorophyll were extracted by 80% acetone, and then the optical density were measured at the wave length of 663 and 645 nm by spectrophotometer. According to the related formulation

2、 we can circulate the Chlorophyll content.Key words: Chlorophyll, Withdraws, Determination绿色植物吸收阳光能量，同化二氧化碳和水，制造有机物质并释放氧气的过 程，称为光合作用。光合作用所产生的有机物质主要是糖类。光合作用能把无机物变成有机物，能蓄积太阳能，还能保护环境。这一切都 离不开叶绿素体这个细胞器，而组成叶绿体的主要成分之一是叶绿素，叶绿素的 作用就是先吸收太阳光能5，然后固定CO2并与h2o同化有机物质。除了在光合作用中起作用之外，叶绿素对人体也有相当大的作用。比如：造 血作用（叶绿素中富含微量元

3、素铁，是天然的造血原料）、提供维生素、维持酶 的活性、解毒作用（叶绿素是最好的天然解毒剂，能预防感染，防止炎症的扩散， 还有止痛功能）、抗病强身（叶绿素在改善体质，祛病强身方面也有很多作用。 如能增强机体的耐受力；还有抗衰老、抗癌、防止基因突变等功能）。叶绿素是植物中特有的一种成分，其他生物体内不含有叶绿素。因此，其他 生物体如动物是无法自身合成足够的能量，供给自体消耗和利用，只能从大自然 中摄取，而植物就可以自供能量。叶绿体中主要有叶绿素：叶绿素a和叶绿素b。它们不溶于水，但能溶于酒 精、丙酮和石油醚等有机溶剂。在颜色上叶绿素a（C55H72O5N4Mg）呈蓝绿色， 而叶绿素b（C55H70

4、O6N4Mg）呈黄绿色。叶绿素是叶绿酸的酯。叶绿酸是双羧酸，其中的两个羧基分别与甲醇（CH3OH） 和叶绿醇（phytol，C20H39OH）发生酯化反应，形成叶绿素1。叶绿素分子含有4个毗咯环，它们和4个甲烯基（=CH一）连接成1个大 环，叫做卟啉环。镁原子居于卟啉环的中央。另外有1个含羰基和羧基的副环（同 素环V），羧基以酯键和甲醇结合。叶绿醇则以酯键与在第IV毗咯环侧链上的丙 酸相结合。图1是叶绿素a的结构式。叶绿素分子是一个庞大的共轭系统7，吸 收光形成激发状态后，由于配对键结构的共振，其中1个双键的还原，或双键结 构丢失1个电子等，都会改变它的能量水平。叶绿素只以电子传递（即电子得失

5、 引起的氧化还原）及共振传递（直接传递能量）的方式，参与光反应。叶绿素分 子具有亲脂性。有条长链的亲脂“尾巴”，对叶绿素分子在类囊体片层上的固定起 着极其重要的作用。叶绿素分子的“头部”是金属卟琳环，镁原子带正电荷，而氮 原子则偏向于带负电荷，呈极性，因而具有亲水性，可以和蛋白质结合。叶绿素 分子的头部和尾部分别具有亲水性和亲脂性的特点，决定了它在类囊体片层中与 其他分子之间的排列关系。绝大部分叶绿素a分子和全部叶绿素b分子具有收集 和传递光能的作用。少数特殊状态的叶绿素a分子有将光能转换为电能的作用3。图1叶绿素a的结构式图2叶绿体的亚显微结构1实验材料与设备1.1实验材料新鲜的玉米叶子（C

6、orn leaf），去粗叶脉，清洗。1.2实验试剂丙酮：80%的丙酮和纯丙酮；碳酸钙少许；石英砂少许.1.3实验仪器Eppendorf5804 离心机、Eppendorf biophotometer 分光光度计、天平、剪刀、 研钵、漏斗、移液管。2实验原理未经分离的叶绿体色素溶液中测定叶绿素a和叶绿素b,其原理：在混合中的 两个组分，他们的光谱吸收峰虽然有明显的差异，但吸收曲线彼此有些重叠，在 这种情况下要分别测定两个组分。可根据Lambeer-Beer定律，通过代数方法，计 算一种组分由于另一种组分存在时对光密度的影响，最后分别得到两种组分的含 量。叶绿素a和b的吸收光谱曲线，叶绿素a的最大

7、吸收峰在663nm，叶绿素b的 最大吸收峰在645nm，吸收曲线彼此又有重叠。根据Lambeer-Beer定律，最大吸收光谱峰不同的两个组分的混合液，它们的 浓度C与光密度OD之间有如下关系ODlYaf+CbfgYag+Cbf叶绿素a和b的80%丙酮溶液，当浓度为1g/L时，比吸收系数K值，如表1： 表1：浓度为1g/L时，比吸收系数K值波长/nm叶绿素a叶绿素b66382.049.2764516.7545.60将表中数值带如上式则得：OD663=82.04*Ca+9.27*CbOD645=16.75*Ca+45.60*Cb经过整理之后，既得到下式：Ca=0.0127OD663 -0.0026

8、9 OD645Cb=0.0229 OD645-0.00468 OD663如果把Ca，Cb的浓度从原来的g/L改为mgL，则上式可改写为下列形式:Ca=12.7 OD663-2.69 OD645（ 1）Cb=22.9 OD645-4.68 OD663（ 2）Ct=Ca+Cb=8.02 OD663+20.21OD645（3）以上三个公式计算出叶绿素a和叶绿素b及总叶绿素的浓度（mg/L）3方法与步骤3.1色素的提取取玉米新鲜叶子，剪去粗大的叶脉并剪成碎快，称取2g放入研钵中加入丙酮 20ml，少许的碳酸钙（加入少许碳酸钙的目的是为了防止在研磨过程中，叶绿素 受到破坏。原理如下：叶绿体中的色素所处的

9、环境具微碱性，实验中，由于研磨 会使细胞结构遭到破坏，细胞液流出，酸性的细胞液就会直接接触叶绿体中色素， 致使叶绿素的分子结构遭到破坏，使叶绿素失镁，呈黄褐色，所以加入少许碳酸 钙是为了中和细胞液的酸性，可起到保护叶绿素的作用）和石英砂，研磨成匀浆， 再加80%丙酮洗涤研钵，一并转入离心管，离心后弃沉淀，上清液用80%丙酮定 容至80ml。并在观察其颜色。3.2测定光密度取上述色素提取液1ml，加80%丙酮4ml稀释后转入比色杯中，以80%丙酮为 对照，分别测定663nm、645nm出的光密度值6。3.3叶绿素的计算按公式（1）（2）（3）分别计算色素提取液中叶绿素a叶绿素b及叶绿素a叶 绿素

10、b的浓度。再根据稀释倍数分别计算色素每克鲜重叶绿素的含量。4结果与分析4.1叶绿素提取试验的结果表2：试验的结果数据Ct（叶绿素的总含量测定值）获得率mg/L第一组20.638310.302%第二组19.502480.312%第三组9.751910.156%数据说明，玉米叶绿素的含量在0.3%左右。在本次试验中，由于仪器问题第三组 数据明显偏离过大，故计算平均值时只采用前两组数值，可得到玉米的叶绿素含量为 0.307%。4.2叶绿素溶液的外观提取的叶绿素的丙酮溶液为翠绿色。如果为黄色等或者含有其他颜色的叶绿 素溶液，则提取失败。4.3试验结果分析通过本次试验，在叶绿素的提取中，由于植物叶子中含

11、有水分，故先用纯丙 酮进行提取，以使色素提取液中丙酮最终浓度近似80%。也可以在配制80%丙酮溶液时，要大于80%，不能小于80%。以达到提取溶液的精确度。在叶绿素的提取试验中，要注意以下几点，由于叶绿素a、叶绿素b的吸收 峰很陡，仪器波长稍有偏差，就会使结果错误。在测试第三次的时候，又从新调 整了仪器的波长，虽然也是同样的数值，但是结果却相差很大。制得的叶绿素提取液，应该盖紧盖子避光，以免接触空气破坏色素，影响实 验效果。光对叶绿素有破坏作用，实验操作应在弱光下进行，且应尽量在短时间 内研磨；色素提取液若混有其他物质而造成浑浊，应重新过滤或离心，以免影响 吸光度的测定，从而影响光密度的测定值

12、；色素吸光度测定前，应按仪器说明及 标准叶绿素a、b对分光光度计的波长进行校正，否则影响叶绿素含量的测定精 度囹。参考文献：1唐微,朱名安，刘俊C3 C4及CAM植物的光合速率日变化及叶绿素含量的比较(M)湖北农业科 学 2002,42谢宇农生物教程(M)“叶绿素的提取和分离”实验方法的几点探索2004, 29(10)3 罗红艺 C3植物、C4植物和CAM植物的比较 高等函授学报(M) 2001, 05期4王金发，生物学精品课程。试验十九叶绿素的提取.2003年10期5王金发，细胞生物学M,第八章叶绿体的光合作用北京：科学出版社.2004.96董无彦，左贤云，邬荆平，无机化学.第十五章吸光光度

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